维生素D为一组存在于动植物组织中的类固醇的衍生物，因其有抗佝偻病作用，也称之为抗佝偻病维生素。目前己知的维生素D至少有10种，但最重要的是维生素D2和维生素D3。维生素D2又名麦角钙化醇，分子式为C28H44O，相对分子质量为396.66；维生素D3又名胆钙化醇，分子式为C27H44O，相对分子质量为384.65。
食品中维生素D的含量很少，且主要存在于动物性食品中。维生素D的含量一般用国际单位（IU）表示，1国际单位的维生素D相当于0.025μg的维生素D。几种富含维生素D的食品中维生素D的含量（IU/100g）如下：奶油50，蛋黄150一400，鱼40一150，肝10一70，鱼肝油800一30000。
维生素D的测定方法有比色法、紫外分光光度法、气相色谱法、液相色谱法及薄层层析法等。其中比色法灵敏度较高，但操作十分复杂、费时。气相色谱法虽然操作简单，精密度也高，但灵敏度低，不能用于含微量维生素D的样品。液相色谱法的灵敏度比比色法高20倍以上，且操作简便，精度高，分析速度快，是目前分析维生素D的最好方法。这里主要介绍三氯化锑比色法。
在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物，呈色强度与维生素D的含量成正比。
皂化与提取同维生素A的测定。如果样品中有维生素A共存，可用以下方法进行分离纯化。
(1)分离柱的制备：取一支具有活塞和砂蕊板的玻璃层析柱。
第一层：加入无水硫酸钠，铺平整。
第二层：将celite540置于碘值瓶中，加入石油醚，振摇，再加入聚乙二醇600，剧烈振摇，使其黏合均匀，然后倒入层析柱内。
第三层：加中性氧化铝。
第四层：加入无水硫酸钠。
轻轻地转动层析柱，使第二层的高度保持在12cm左右。
(2）纯化：先用石油醚淋洗分离柱，然后将样品提取液倒入柱内，再用石油醚继续淋洗。弃去最初收集的滤液，再用容量瓶收集淋洗液至刻度。将淋洗液移入分液漏斗中，加水洗涤3次（去除残留的聚乙二醇，以免与三氯化锑作用形成混浊物，影响比色）。将上述石油醚层通过无水硫酸钠脱水后，置于浓缩器中减压浓缩至干或在水浴上用水泵减压抽干，立即加入三氯甲烷溶解备用。
根据样品溶液的吸收值，从标准曲线上查出相应的含量，然后样品中维生素D含量根据下列公式计算：
X=(ρ×V)/(m×1000)×100
式中;X—样品中维生素D的含量，mg/100g;
ρ—标准曲线上查得样品溶液中维生素D的含量，μg/mL如按国际单位，每国际单位=0.025μg维生素D);
V一样品提取后用三氯甲烷定容之体积，mL;
m—样品的质量，g。
说明及注意事项如下。
(1)食品中维生素D的含量一般很低，而维生素A、维生素E、甾醇等成分的含量往往都大大超过维生素D，严重干扰维生素D的测定，因此测定前必须经柱层析除去这些干扰成分。
(2)操作时加入乙酰氯可以消除温度的影响，使灵敏度比仅用三氯化锑提高约3倍，并可减少部分甾醇的干扰。
(3）此法不能区分维生素D2和维生素D3，测定值是两者的总量。
