【实验器材】
(1)仪器注射器、离心机、电子天平、高压蒸汽灭菌锅、烧杯、磁力搅拌器、容量瓶、灭菌过滤器、移液器及配套枪头、吸管、弯镊等。
(2)材料相关动物、滤纸、称量纸、滤膜。
(3)试剂NaOH、Hank’s液、新鲜制备的三蒸水、乳蛋白粉、鸡胚、牛心、碘酒、酒精、胰酶、HCl、酵母浸膏、醋酸等。
【操作方法与步骤】
(一)血清的制备和使用
1．血清的制备
(1)用乙醚等麻醉动物，从动物体表大的静脉或动脉用注射器直接抽血采集血液，或解剖出动脉或心脏再抽血，然后立即注入无菌管中。
(2)室温静置，待凝血坚实血清析出后，吸出上清液，3000～4000r／min离心；然后再分离一次上清液，即可应用。
(3)制备中一切操作如不能做到完全无菌，则最终血清尚须通过0．22μm微孔滤膜滤过除菌。
(4)血清是比较黏稠液体，滤过缓慢，比较麻烦。因此操作中要保证做到无菌才好。
2．血清的热灭活
(1)选用与血清瓶同规格的对照瓶一个。
(2)对照瓶内放入与血清等体积的水。
(3)温度预试：对照瓶内插入2～3支经挑选的温度计(保证测试温度的准确性)，放入水浴箱中，接通电源，调节温度控制钮，使温度计所示温度保持在56℃。
(4)血清灭活：血清瓶与带温度计的对照瓶一齐放入水浴箱中，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30min。
(5)大瓶血清灭活后，进行分装。
（6)分装后，抽样做无菌试验，一70～一20℃保存。
注意：灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生毒性作用。血清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分，如生长因子，因此也有人提出血清不经灭活直接用于培养，这样做的前提是确认血清中不含补体成分。对于一些品质高的胎牛血清和新牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。
3．血清的使用
(1)血清使用时，首先要观察血清的颜色和清亮度，若颜色偏红，或色浅，或出现沉淀，表示血清质差或变质，应当更换。
(2)若使用冻融后的血清，其最上层无色透明，活力最差，使用前应将其摇匀。
(3)血清反复冻融使用，其效价下降又容易污染。
(4)长时间冻存的血清，一旦冻融后出现沉淀物(此物抑制细胞生长)，应弃去。
(5)若有条件，先购买少量几种批号血清，进行细胞生长曲线、细胞克隆率检查，从而筛选出质量好的血清。
(6)为了使整个试验结果稳定，以便前后比较，应使用同一批号血清。
(7)血清使用浓度一般为5％～20％，最常用的是10％。
(8)血清使用过多，容易使培养中的细胞发生变化，特别是一些二倍体的无限细胞系，迅速生长之后容易发生恶性转化。
4．血清的保存
需要长期保存的血清必须储存于一70～一20℃低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1个月。由于血清结冰时体积会增加约l0％，因此，血清在冻入低温冰箱前，必须预留一定体积空间，否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。切勿将血清在37℃放置太久，否则血清会变得浑浊，同时血清中的有效成分会破坏而影响血清质量。
5．血清的解冻
采用逐步解冻的方法。
(1)一70～一20℃低温冰箱中保存的血清放人4℃冰箱中溶解1d。
(2)然后移入室温，待全部溶解后再分装。
(3)在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。
(4)切勿直接将血清从一20℃进入37℃解冻，这样因温度改变太大，容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。
(二)0．5％水解乳蛋白制备和使用
(1)称量：称0．5g水解乳蛋白粉入烧杯中，加少许灭菌Hank’s液调成糊状。
(2)溶解：补加Hank’s液至i00mL，不断搅拌，令充分溶解，置室温1～2h，并不时搅拌；然后移入室温，待全部溶解后再分装。
(3)滤过：滤纸滤过，分装入瓶中。
(4)灭菌：10磅10min高压蒸汽灭菌后，4℃冰箱保存。
(5)使用：与合成培养基按照体积比1：1混合使用。
(三)胚胎浸出液的制备
1．鸡胚浸出液
(1)孵化：选健康受精鸡胚，置入37℃温箱孵化；箱内置有水皿，以保持箱内湿度，每日翻动胚一次(180。)。
(2)处理：孵育至9～12d，取出鸡胚置小烧杯中，令气室端向上，用碘酒和酒精消毒蛋壳。
(3)取胚：用消毒剪剪除气室端蛋壳，小心拨开尿囊膜，用弯玻棒或弯镊伸到胚体颈下方，轻轻挑起鸡胚置入平皿中。
(4)清理：去掉胚眼、血块、尿囊膜等物；用BSS冲洗鸡胚。
(5)粉碎：置入烧杯中用剪刀剪碎胚体后，再用组织研磨器研磨；或放入20～50mL注射器中(无针头)直接压挤入无菌小烧杯中。
(6)浸出：加入等量的Hank’s液，用吸管轻轻吹打均匀，密封后置37℃温箱中30min。
(7)分离：3000r／min，离心30min，无菌取上清液分装入小瓶中，一20℃保存；用前再离心一次，取上清液使用；全部操作过程要保持无菌，要剔除尿囊膜和胚眼等，以免对细胞产生不良作用。
2．牛心肌浸出液
该浸液主要用作支原体检查。制备方法如下：
(1)新鲜牛心用蒸馏水洗两次，切开除去内膜、脂肪及结缔组织等，用绞肉机将心肌绞碎，称取250g加双蒸水900mL，加NaCl5g，放入三角烧瓶内。
(2)56℃水浴加温10~20min，再加入胰酶2．5g，待胰酶全部溶解后用NaOH调节pH至8．0，以增强消化能力，于56℃消化2h，并不断搅拌，保持pH8．0左右。
(3)将心肌消化悬液用HCI调至pH6．0左右，煮沸5～10min，再用四层纱布滤去肉渣，略加压力将肉汁挤出，将浸出液加双蒸水至1000mL。
(4)加酵母浸膏1g搅拌之，调pH至8．0再煮5min，四层纱布(中间垫一层脱脂棉)过滤，再用滤纸过滤，pH保持在8．0，即成牛的心肌浸液，115℃、15min高压灭菌，置4℃冰箱保存备用。
(四)鼠尾胶原的制备与使用
1．鼠尾胶原的制备方法
(1)配制0．1%醋酸溶液，10磅10min高压灭菌备用。
(2)取组织：取体重250g左右大白鼠一只，从尾根部切断鼠尾，置75％酒精中浸泡30min；无菌条件下将鼠尾切成1．5cm小段，剔除皮毛，抽出尾腱置平皿中。
(3)溶解：取1．5g剪碎尾腱浸入150mL0．1%醋酸溶液，置4℃冰箱中，并不时摇动，48h后，移入灭菌离心管中。
(4)分离：以4000r／min离心30min(最好在4℃条件)，吸取上清液，l0磅10min高压灭菌后分装入小瓶中，20℃冰箱保存。
(5)残渣可再加40mL醋酸液作用24h后，离心收集保存。
2．使用方法
(1)用吸管吸少许胶原涂于灭菌培养瓶内壁培养面上，不宜太厚，以倾斜瓶时不流动为准。
(2)向培养瓶内通以氨气后封上瓶盖；或用浸有氨水的棉球堵塞瓶口(或不用氨气处理，而是置37℃温箱过夜；或置室温48h，再用无菌蒸馏水冲洗晾干亦可)后置灭菌饭盒内。
(3)作用30min，待胶原凝固。
(4)用无菌生理盐水或BSS液或基础营养液洗涤胶原面后，再经细胞培养液浸泡过夜，37℃干燥备用。
