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pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ载体构建及在兔骨髓间充质干细胞中的表达

• 发布日期：2016/12/6 14:42:32 阅读次数：1463
•     pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ载体构建及在兔骨髓间充质干细胞中的表达* 
  
      黄娇甜，刘厂辉，钟警，曾艳辉 
  
      摘要 
  
      背景：过氧化物酶体增殖物激活受体γ是细胞分化重要的调控因子，通过调节其他转录因子的表达，参与调节骨髓间充质 干细胞的分化。 
  
      目的：构建pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ真核表达载体，体外转染兔骨髓间充质干细胞，为过氧化物酶体增 殖物激活受体γ受体功能和基于过氧化物酶体增殖物激活受体γ受体靶点的药物筛选提供分子研究平台。 设计、时间及地点：单一样本观察，于2007-09/2008-07在南华大学附属一医院临床研究所完成。 
  
      材料：选择雄性2~5月龄新西兰大白兔，用于分离培养骨髓间充质干细胞。 
  
      方法：应用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞，贴壁法不断纯化。从正常小鼠的肝组织中提取总RNA，反转录-聚合酶 链反应法获得过氧化物酶体增殖物激活受体γcDNA，经XhoⅠ，ApaⅠ双酶切，定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1， 构建重组质粒pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ。 主要观察指标：经酶切分析和测序鉴定重组质粒中过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因的完整性和真实性，脂质体介导下 体外转染骨髓间充质干细胞，荧光倒置显微镜下观察瞬时表达及转染效率，提取总RNA和总蛋白，进行反转录-聚合酶链 反应和Western blot检测。 
  
      结果：获得的过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因片段经酶切和测序鉴定正确，重组质粒经酶切和测序鉴定证实构建正确， 成功转染骨髓间充质干细胞，在其中检测到目的基因及蛋白表达。 
  
      结论：实验成功构建了pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ重组质粒，同时在转染的骨髓间充质干细胞中获得了过 氧化物酶体增殖物激活受体γ的高效表达。 
  
      关键词：骨髓间充质干细胞；过氧化物酶体增殖物激活受体γ；基因转染
  
      0引言 
  
      过氧化物酶体增殖物激活受体γ是核受体 中的超家族,其从转录水平参与许多细胞功能 及病理生理的调控过程，包括脂肪细胞分化、 糖、脂代谢、炎性反应、动脉粥样硬化、癌细 胞的分化形成等[ 1-2]，因而其极有希望成为治疗 动脉粥样硬化、高血压、糖尿病及肿瘤等疾病 新的药物靶标 [3-5] 。 骨髓间充质干细胞在特定的体内外环境下 可定向诱导其向心肌细胞、脂肪细胞、骨骼肌 细胞、成骨细胞、软骨细胞等方向分化。近年 来发现脂肪细胞在分化成熟过程中可分泌多种 内分泌因子，干扰正常的内分泌环境[ 6]，参与某 些心血管疾病的发生[ 7-9]。
  
      因此，深入了解骨髓 间充质干细胞向脂肪细胞分化的机制对于干预 骨髓间充质干细胞定向分化有重要意义。 文章通过构建pEGFP-N1-过氧化物酶体 增殖物激活受体γ重组质粒，经脂质体介导体 外转染原代培养兔骨髓间充质干细胞，初步验 证外源性过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因 转染及修饰骨髓间充质干细胞的可行性。 
  
      1材料和方法 
  
      设计：单一样本观察。 时间及地点：2007-09/2008-07在南华大 学附属一医院临床研究所完成。 材料：选择雄性2~5月龄新西兰大白兔，体 质量2.0~2.5 kg，购于南华大学动物部。实验过 程中对动物处置方法符合科学技术部2006年发 布的《关于善待实验动物的指导性意见》 [10] 。
  
   
  
      实验方法： 
  
      骨髓间充质干细胞的分离、培养：将大白兔用 速眠新0.1~0.2 mL/kg肌注全身麻醉，无菌条件 下，16号骨髓穿刺针于股骨大转子处进针， 用肝素化的无菌注射器抽吸骨髓5 mL，轻轻 铺于等量的淋巴分离液上，2 000 r/min离心 30 min。此时,离心管中出现4个层面，用毛细 吸管轻轻吸出第2层，即白色絮状层，移入另 一无菌离心管中，加入PBS 5 mL，2 000 r/min 离心5 min，弃去上清液加入含体积分数为0.1 的胎牛血清培养基5 mL,均匀吹散沉淀后接 种于75 mL培养瓶中，置于37℃、体积分数为 0.05的CO2培养箱中恒温培养,于第3天取出 培养瓶给予首次换液,去除未贴壁细胞。
  
      以后 每3 d换液1次，倒置相差显微镜下观察其生长 状况。观察细胞达80%融合后，加入2.5 g/L胰 蛋白酶消化1∶2传代，取第2代细胞应用。 重组质粒pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活 受体γ的构建：取正常小鼠肝脏组织，Trizol法 抽提总RNA，以Oligo(dT)18为引物，反转录试 剂盒合成cDNA第1链。
  
      设计引物：
  
   
  
      分别含XhoⅠ和ApaⅠ酶切位点。按照 反转录-聚合酶链反应试剂盒的方法配制聚 合酶链反应反应体系，以获得的反转录产物 为模板进行聚合酶链反应扩增，反应条件为： 94℃3 min,94℃30 s,60℃30 s,72℃ 1.5 min进行35个循环，之后72℃延伸10 min， 4℃终止聚合酶链反应。10 g/L琼脂糖凝胶电 泳鉴定聚合酶链反应产物，随后经电泳，胶回 收预期条带。用XhoⅠ和ApaⅠ双酶切聚合 酶链反应产物和载体pEGFP-N1，电泳纯化后 回收过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因和 线性化的pEGFP-N1载体，用T4DNA连接酶连 接过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因和线 性化的载体。转化感受态Top10菌，用含卡那 霉素的LB平板筛选阳性克隆。分别挑取数个菌 落摇菌过夜，次日提取质粒进行酶切分析、聚 合酶链反应鉴定，并送上海生物技术工程有限 公司测序。 
  
      pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ重组 质粒体外转染骨髓间充质干细胞：转染前1 d将第2代骨髓间充质干细胞接种于24孔培养板，分为pEGFP- N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ转染组、pEGFP-N1 空载体转染组、未转染组。每组3复孔，每孔细胞数调节 至2×10 5 。
  
      加1 mL含体积分数为0.1的胎牛血清的 L-DMEM培养基。在37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱 中培养至细胞密度达80%~90%，将15μLpEGFP-N1- 过氧化物酶体增殖物激活受体γ和3μL lipofectamine 2000分别溶于150μL无血清L-DMDM培养基中，室温 静止5 min，之后将两液混合，室温静置20 min。加无血 清培养基于24孔板中，将细胞用无血清培养基冲洗2次, 之后加上述混合液100μL/孔,前后摇匀,室温5 min,每 孔再补加900μL无血清培养基，37℃孵育4~6 h后更换 含体积分数为0.1的胎牛血清的L-DMDM培养基。同法将 空载体pEGFP-N1转入骨髓间充质干细胞。 转染后细胞荧光的表达：分别在转染后24，48，72 h、 
  
      1，2，3和4周，在荧光倒置显微镜下观察、摄影。 转染后细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γmRNA表达 的检测：取传代培养的转染细胞和对照细胞，按Trizol 试剂盒说明提取总RNA。
  
   
  
      采用QIAGEN OneStep反转录-聚合酶链反应试剂 盒反应体系。反转录-聚合酶链反应条件为：94℃ 4 min,94℃1 min,55℃1 min,72℃1 min 20 s, 72℃10 min,35个循环。10 g/L的琼脂凝胶电泳。 转染后细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ蛋白表达的 检测：收集各组细胞,用蛋白裂解液和PMSF裂解细胞, 以提取细胞蛋白质。BCA试剂测定蛋白含量，煮沸 5~10 min使蛋白变性；冷却后上样,经SDS-PAGE，电 泳结束后,转膜、抗体结合，荧光显影,扫描分析。为 保证每孔加等量蛋白质，显影后的膜重新封闭后,再孵 一抗β-actin做对照，余后步骤同前述。 主要观察指标：反转录-聚合酶链反应法检测转染 细胞中目的基因的表达，Western blot法检测转染细胞 中蛋白的表达。 
  
      设计、实施、评估者：实验设计、实施、评估均为 文章作者，均经过正规培训，未采用盲法评估。 
  
      2结果 
  
      2.1骨髓间充质干细胞生长情况
  
   
  
      2.2重组真核表达质粒的鉴定XhoⅠ和ApaⅠ双 酶切电泳图出现约4.7 kb和1.5 kb 2条片断，和质粒载体 及预计值大小符合。见图2。
  
   
  
      如图3所示，转染后24 h即可见发绿色荧光的细 胞。48~72 h阳性细胞逐渐增多，强度增强，多为明 亮的绿色荧光，转染效率15%~20%。1周后表达绿 色荧光的细胞逐渐减少，荧光逐渐减弱。到4周时， 仍可见散在的荧光。其中pEGFP-N1空载体转染兔 骨髓间充质细胞后，增强型绿色荧光蛋白均匀地充 满胞浆和胞核。pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激 活受体γ重组质粒转染骨髓间充质干细胞后，荧光 充满胞浆和胞核但以胞核最明显，同时pEGFP-N1 空载体转染组绿色荧光较pEGFP-N1过氧化物酶体 增殖物激活受体γ转染组鲜艳。空白对照组未见荧 光表达。 
  
      2.4转染后细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ mRNA的表达反转录-聚合酶链反应结果显示，基 因转染组（转染pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激 活受体γ）出现约189 bp大小的电泳条带，而空载体 转染组（转染pEGFP-N1）和未转染组则未出现，见 图4。
  
   
  
      2.5转染后细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ蛋白 的表达Western Blot结果表明，基因转染组蛋白表达 产物能够与过氧化物酶体增殖物激活受体γ抗体结合， 具有过氧化物酶体增殖物激活受体γ活性，说明构建的 重组质粒pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ 能在骨髓间充质干细胞中诱导表达，其蛋白产物具有免 疫原活性。 
  
      空载体转染组及未转染组蛋白表达产物均不可与 过氧化物酶体增殖物激活受体γ抗体结合。 提示基因转染组高表达过氧化物酶体增殖物激活 受体γ蛋白，空载体转染组和未转染组不表达过氧化物 酶体增殖物激活受体γ蛋白，见图5。
  
   
  
      3讨论 
  
      过氧化物酶体增殖物激活受体γ配体噻唑烷二 酮类可抑制大脂肪细胞分泌胰岛素抵抗分子-肿瘤坏 死因子γ和胰岛素抵抗因子促进脂肪细胞的分化、增 加小脂肪细胞数目，增进胰岛素相关信号传导，加速 外周组织三酰甘油的分解，促进脂肪组织中三酰甘油 合成，综合的结果使胰岛素敏感性提高[ 11]。
  
      新近的研 究表明，活化的过氧化物酶体增殖物激活受体γ可抑 制巨噬细胞一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子γ和基质金 属蛋白酶9等炎性相关蛋白的表达等效应，从而显示 出抗动脉粥样硬化的作用[ 12]；此外，研究发现过氧化 物酶体增殖物激活受体γ配体还在结肠、乳腺和前列 腺癌等多种肿瘤中表现出抗肿瘤效应[ 13]。
  
      可以认为， 在治疗包括胰岛素抵抗、高血糖、动脉硬化及肿瘤等 多种疾病中，以过氧化物酶体增殖物激活受体γ作为 靶标极具应用前景。但是对于过氧化物酶体增殖物激 活受体γ在胰腺、心肌等组织中的生物学功能目前无 深入研究，而在动脉粥样硬化发病中的作用研究也有 各个实验结果也不尽相同[ 14-15]。
  
      因此，研究某些特定 组织中过氧化物酶体增殖物激活受体γ的生物学功 能必将为将来过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动 剂的临床应用提供依据。 由于长期使用噻唑烷二酮类类药物可能伴发浮 肿和体质量增加，个别患者还出现严重的肝毒性等副 作用[ 16]，寻找既保留治疗作用又无毒副作用的选择性 过氧化物酶体增殖物激活受体γ配体或激动剂显得 尤为重要。中药活性成分蕴藏丰富，筛选并研究中药 单体中可能的过氧化物酶体增殖物激活受体γ配体 将为今后开发利用提供实验依据。 
  
      实验通过构建pEGFP-N1-过氧化物酶体增殖物 激活受体γ表达质粒，利用脂质体介导法转染骨髓间 充质干细胞，根据反转录-聚合酶链反应方法检测过 氧化物酶体增殖物激活受体γ基因的mRNA、 Western Blot实验检测过氧化物酶体增殖物激活受体 γ蛋白表达；同时观察转染前后骨髓间充质干细胞细 胞的生长及增殖，研究结果表明，pEGFP-N1-过氧化 物酶体增殖物激活受体γ转染骨髓间充质干细胞后 24 h就能观察到绿色荧光，48~72 h阳性细胞逐渐增 多,强度增强,多为明亮的绿色荧光,转染效率约 20%。
  
      1周后表达绿色荧光的细胞逐渐减少,荧光逐渐 减弱,到4周时,仍可见散在的荧光。作者还观察到转 染细胞与非转染细胞基本生物学特性没有变化。这说 明骨髓间充质干细胞可作为过氧化物酶体增殖物激 活受体γ的受体细胞，而绿色荧光蛋白基因可作为一 种高效的报告基因。为了能够成功转染,转染前一定 要使细胞密度达到80%~90%，采用无血清、无抗生 素转染，质粒和脂质体浓度比例为1∶2到1∶3效果最 佳。进一步为研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ在 脂肪细胞分化的分子机制提供实验基础；为过氧化物 酶体增殖物激活受体γ受体功能和基于过氧化物酶 体增殖物激活受体γ受体靶点的药物筛选提供分子 研究平台。也为进一步研究过氧化物酶体增殖物激活 受体γ在胰岛细胞、脂肪组织和骨骼肌细胞中的生物 学功能奠定了良好的基础。 
  
      作者选择pEGFP-N1质粒作为重组质粒的构建的 平台主要基于以下考虑：
  
  ①pEGFP-N1具有较强的启 动子序列和容易克隆的位点，易用于真核细胞的转 染，研究工作中较为实用。
  
  ②该载体中构建有绿色荧 光蛋白基因，转染成功后可表达绿色荧光蛋白，经 488 nm蓝光激发发出绿色荧光，是较为理想的报告基 因。
  
  ③其中含有SV40ori复制元件，有可能随宿主细 胞分裂跟随胞浆遗传给子代细胞，可以在一定程度上 保证目的基因稳定传递。 
  
      同时骨髓间充质干细胞是较为成熟的组织工程 种子细胞，已经在多种外源基因的表达中进行了成功 的运用，与质粒pEGFP-N1的配套使用也有成功的报 道。干细胞不仅易于外源基因的转染和表达,而且转 染外源基因并不影响干细胞多向分化能力和体外增 殖能力，此外,转染后的干细胞仍然具有很强的体外 增殖能力并可以向成骨细胞、脂肪细胞和肌细胞分 化。因此，干细胞由于其具有取材便捷、体外扩增能 力强、基因转染效率高、转染后稳定表达、可自体回 输从而避免了免疫排斥反应等特点已成为基因操作 的干细胞平台,故实验选择骨髓间充质干细胞作为目 的基因的受体细胞，并选择其为进一步药物研究的模 型。 
  
  

      4参考文献:略

  来源：中国化学试剂网