NCS-核黄素-盐酸曲普利啶化学发光反应及其分析应用研究
王 娜，吴丽红，卜 敏，聂 菲*
( 西北大学分析科学研究所，西安 710069)
摘 要:以荧光试剂核黄素为化学发光试剂，构建了 N-氯代丁二酰亚胺( NCS) －核黄素 －盐酸曲普利啶化学发光新体系。利用此体系建立了测定盐酸曲普利啶的化学发光分析新方法，方法的线性范围为 1. 0 ×10－ 8～ 9. 0 × 10－ 7g / mL，检出限为8 ×10－ 9g / mL，对浓度为 1. 0 × 10－ 7g / mL 盐酸曲普利啶溶液进行 11 次平行测定的相对标准偏差( RSD) 为0. 9 %。此法已用于药品中盐酸曲普利啶含量的测定，结果与药典测定结果一致。对该化学发光反应的机理也进行了初步的探讨。
关键词: 化学发光; 核黄素; 盐酸曲普利啶; N-氯代丁二酰亚胺( NCS)
中图分类号: O657. 3 文献标识码: A 文章编号: 1000-0720( 2011) 07-045-05
盐酸曲普利啶属特异性组胺 H1 受体阻断剂，该药具有选择性好、活性强而副作用小的特点，临床上广泛应用于治疗各种过敏性疾病［1 ～3］。目前测定盐酸曲普利啶的方法有高效液相色谱法［4，5］、电化学分析法［6，7］、分光光度法［8］、非水滴定法［9］等。研究发现，核黄素可以吸收 N-氯代丁二酰亚胺( NCS) 氧化分析物时释放的化学能而产生化学发光［10］。本文以核黄素为化学发光试剂，构建了NCS － 核黄素 － 盐酸曲普利啶化学发光新体系，利用此体系建立了测定盐酸曲普利啶的化学发光分析新方法。通过对有关化学发光光谱、荧光光谱、紫外吸收光谱以及对其它相关试验结果的分析，提出了该化学发光反应可能的机理。本文建立的流动注射化学发光法已用于药片和尿样中盐酸曲普利啶含量的测定，结果令人满意。
1 实验部分
1. 1 仪器与试剂
IFFM-E 型流动注射化学发光分析仪( 西安瑞迈电子科技公司) ; Remax 化学发光分析数据处理系统( 西安瑞迈电子科技公司) ; 970CRT 荧光分光光度计( 上海分析仪器总厂) ; TU －1901 紫外可见分光光度计( 北京普析通用仪器公司) ; PHS － 3C精密酸度计( 上海大普仪器公司) 。
盐酸曲普利啶标准溶液( 1. 00 ×10－ 3g / mL) : 称取0. 0500 g 盐酸曲普利啶( 对照品，Sigma 公司) ，用水溶解并定容于 50 mL 容量瓶中; 核黄素溶液( 8. 0× 10－ 4mol / L) : 称取 0. 075 g 核黄素( 分析纯) ，用7. 5 mL 1. 0 mol / L NaOH 溶 解 并 用 水 定 容 于250 mL容量瓶中; NCS 溶液( 9. 0 × 10－ 3mol / L) : 称取0. 30 g NCS ( 化学纯) 用水溶解并定容于250 mL容量瓶中。所用其它试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。
阳离子交换柱的制备［11，12］: 将阳离子交换树脂( 有效粒径为0． 4 ～0． 6 mm) 用水浸泡使其溶胀，再用4. 0 mol/L 的HCl 浸泡2 d 以除去杂质，然后用去离子水洗至中性。将活化的树脂填充入 5 mL 的酸式滴定管内约15cm，柱的两端分别塞以玻璃纤维以防树脂流出或浮动，备用。
1. 2 实验方法
流动注射化学发光分析系统的流路如图 1 所示，a，b，c，d 四道分别插入 NCS 溶液、核黄素溶液、H2O( 载流) 和盐酸曲普利啶溶液。通过进样阀将NCS 溶液和核黄素溶液的混合物注入载流中，再与盐酸曲普利啶溶液混合产生化学发光。记录化学发光信号，以相对峰高定量。
2 结果与讨论
2. 1 反应机理探讨
测得 NCS ( 9. 0 × 10－ 3mol / L) － 核黄素( 8. 0× 10－ 4mol / L) － 盐酸曲普利啶( 1. 0 × 10－ 5g / mL)混合溶液的 pH 值是12. 1。绘制了 pH12. 1 的核黄素溶液及 NCS － 核黄素 － 盐酸曲普利啶溶液的荧光光谱( 图 2) 。
由图 2 可见，两种溶液的最大荧光波长均为536 nm，这表明核黄素仍然存在于 NCS － 核黄素 －盐酸曲普利啶反应后的溶液中。用改装的970CRT荧光分光光度计绘制了 NCS － 核黄素 － 盐酸曲普利啶反应的化学发光光谱( 图 3) 。从图中可以看出，NCS － 核黄素 － 盐酸曲普利啶反应化学发光光
谱的最大化学发光波长为 536 nm，这与核黄素的最大荧光波长相同，因此可以比较肯定地认为NCS － 核黄素 － 盐酸曲普利啶化学发光反应的发光体是核黄素。
分别绘制了 pH 12. 1 的核黄素溶液、NCS 溶液、盐酸曲普利啶溶液、NCS － 盐酸曲普利啶溶液、NCS-核黄素溶液以及 NCS － 核黄素 － 盐酸曲普利啶混合溶液的紫外吸收光谱( 图 4) 。可以看出，NCS 溶液与盐酸曲普利啶溶液混合后，盐酸曲普利啶在 235、210 nm 处的特征吸收峰消失，而在239 nm 处出现一个新的吸收峰，这说明 NCS 氧化了盐酸曲普利啶。在 NCS － 核黄素 － 盐酸曲普利啶混合溶液的紫外吸收光谱中，核黄素在 267、374、445 nm 处的特征吸收峰略有降低，而盐酸曲
普利啶在 235、210 nm 处的特征吸收峰消失，这表明 NCS － 核黄素 － 盐酸曲普利啶混合溶液中，NCS与盐酸曲普利啶发生反应，而溶液中还存在着较多的核黄素。
根据以上试验结果推测，NCS － 核黄素 － 盐酸曲普利啶化学发光反应可能的机理是: NCS 在碱性条件水解生成的 ClO－氧化盐酸曲普利啶，同时释放一定的能量，溶液中的核黄素吸收反应释放的能量而被激发，激发态的核黄素回到基态时产生化学发光。该反应机理可简单表示如下:
2. 2 化学发光反应的动力学性质
研究了 NCS － 核黄素 － 盐酸曲普利啶体系的化学发光反应动力学性质。从反应的动力学曲线( 图 5) 可以看到: 将 NCS 溶液注入到盐酸曲普利啶和核黄素的混合溶液中，1 s 即得到最大的化学发光信号，6 s 信号衰减 95%。这表明 NCS － 核黄素 － 盐酸曲普利啶反应是一个快速的化学发光反应。
2. 3 测定条件的选择
2. 3. 1 流路 为了获得最大的信号，最终选择了如图 1 所示的流路。采用此流路时，NCS 和核黄素的混合溶液与样品溶液能迅速接触，充分地混合而发生反应，可得到较强的化学发光信号。
2. 3. 2 流速 由泵 2 控制的流速对化学发光信号的检测有很大影响。从反应的动力学性质可知，此化学发光反应是一个很快的反应。如果流速过小，当混合液通过检测器时，反应可能已经衰减，检测不到最大的化学发光信号。因此，应适当增大流速。在现有的仪器条件下，综合考虑试剂的消耗以及精 密 度 等 因 素，最 终 选 择 泵 2 的 流 速 为4 mL / min( 管内径为 0. 8 mm) 。
2. 3. 3 反应介质的碱度 NCS 在碱性条件下才具有较强的氧化性，此时，它水解生成了 ClO－。由于 NCS 的碱性溶液很不稳定，故将 NaOH 加到核黄素溶液中调节反应介质的碱度。在 1. 0 × 10－ 3～ 1. 0 × 10－ 1mol / L 范围内对核黄素溶液中 NaOH的浓度进行了选择。结果表明，当核黄素溶液中NaOH 的浓度为 3. 0 × 10－ 2mol / L 时，可获得最大的化学发光信号。
2. 3. 4 核黄素溶液的浓度及稳定性 核黄素吸收 NCS 氧化盐酸曲普利啶反应的化学能产生化学发光，其浓度对化学发光反应有重要的影响。在1. 0 × 10－ 4～ 8. 0 × 10－ 3mol / L 范围内对核黄素溶液浓度进行了选择。结果表明，核黄素的浓度为8. 0 × 10－ 4mol / L 时，可检测出最大的化学发光信号。
考察了核黄素溶液( NaOH 浓度为 3. 0 × 10－ 2mol / L) 的稳定性，结果表明，在室温下，8. 0 × 10－ 4mol / L 的核黄素溶液在 5h 内是稳定的。
2. 3. 5 NCS 溶液的浓度及稳定性 NCS 在此化学发光反应中是氧化剂，其浓度的大小影响化学发光信号的强弱。1. 0 × 10－ 3～ 5. 0 × 10－ 2mol / L 范围内考察了 NCS 溶液的浓度与化学发光强度的关系。根据试验结果，选择 NCS 的浓度为 9. 0 ×10－ 3mol / L。
NCS 溶液的稳定性试验结果表明，浓度为 9. 0× 10－ 3mol / L 的 NCS 溶液在 7 h 内是稳定的。
2. 4 线性方程及检出限
在选定的实验条件下，盐酸曲普利啶的浓度在 1. 0 × 10－ 8～ 9. 0 × 10－ 7g / mL 范围内与化学发光强度呈线性关系( 相关系数为 0. 9996) ，回归方程为 I =11. 5ρ +5. 92 ( ρ 为盐酸曲普利啶的浓度，10－ 8g / mL) 。按照 IUPAC 建议，测得方法的检出限为 8 ×10－ 9g / mL。对浓度为 1. 0 × 10－ 7g / mL 盐酸曲普利啶标准溶液进行 11 次平行测定的 RSD为 0. 9%。
2. 5 干扰研究
在选定的实验条件下，对 1. 0 × 10－ 7g / mL 盐酸曲普利啶溶液进行测定，考查了赋形剂以及一些常见离子的干扰情况。结果表明，在 95% 的置信水平上，1000 倍的葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉; 500 倍的糊精、尿素、CO2 －3; 200 倍的 K+、Ca2 +、Ba2 +、Mg2 +、SO2 －4、Cl－、NO－3; 100 倍的糊精、50 倍的柠檬酸、硬脂酸; 20 倍的 Cu2 +; 10 倍的 Al3 +、Pb2 +、Zn2 +、尿酸; 5 倍的抗坏血酸、Ni2 +、Cr3 +; 1 倍的Fe2 +、Fe3 +; 0. 01 倍的 Mn2 +均不产生干扰。
2. 6 样品分析
2. 6. 1 胶囊中盐酸曲普利啶的含量测定 分别取市售三种不同批号的盐酸曲普利啶胶囊( 含盐酸曲普利啶约 2. 5 mg/片) 各 10 粒，取其中的内容物混匀。分别称取相当于 1 粒量的盐酸曲普利啶于 100 mL 容量瓶中，加水溶解并稀释到标线，摇匀，准确移取 0. 25 mL 上清液，定容至 50 mL，用作样品溶液。按图 1 所示流路测定化学发光强度，以确定样品中盐酸曲普利啶的含量，并用文献的方法( 高效液相色谱法)［4］进行对照试验，结果列于表 1。t 检验结果表明，两种方法的测定结果在95% 置信水平上无显著性差异。
2. 6. 2 尿样中盐酸曲普利啶的含量测定 取三位健康志愿者的空白尿样 1 mL，分别加入一定量的盐酸曲普利啶标准溶液于 100 mL 容量瓶中，然后通过阳离子交换柱除去干扰的阳离子，弃去初滤液，其余作为样品溶液，进行分析。分析结果列于表 2。同时，进行回收实验。t 检验的结果表明，在95 % 的置信水平上，回收率与 100 % 无显著性差异。
3 结论
本文发现核黄素可以吸收某一氧化还原反应释放的化学能而产生化学发光，并且将这一化学发光性质很好地应用到盐酸曲普利啶的化学发光分析中。与其他测盐酸曲普利啶的方法相比较，所建方法具有简单、快速、灵敏度高的优点。另外，将荧光试剂核黄素用作化学发光试剂进行化学发光分析，为探索和构建类似的氧化剂 － 荧光试剂化学发光反应体系，进一步拓展化学发光分析研究领域提供了有益的思路，丰富了人们对化学发光反应的认识。
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来源：中国化学试剂网
