l.原理
样品经脱水后，用环己烷在脂肪抽提器中抽提，或经皂化后抽提；提取液经液一液分配后，再经柱层析纯化、浓缩；浓缩液在乙酰化纸上点样、展开、分离出的B(a)P在紫外光(波长365 nm或波长254 nm)下照射产生蓝紫色荧光斑点，然后溶出荧光物质，用荧光分光光度计检测其荧光强度(激发波长386 nm、发射波长405 nm)，与标准比较定量。
2.仪器 荧光分光光度计及紫外灯(波长365 nm)。
3.试剂
①环己烷(重蒸)。
②二氯甲烷(重蒸)。
③苯(重蒸)。
④醋酸酐。
⑤浓H2SO4。
⑥KOH。
⑦无水Na2SO4。
⑧硅胶(60-1100目)。
⑨中性Al203(100~200目)，经130℃活化4 h。
⑩B(a)P标准贮存液[100 μgB(a)P／mL]：准确称取纯品苯B(a)P 10.o mg，用环己烷溶解并定容至100 mL。
⑪B(a)P标准溶液：1μgB(a)P／mL。
⑫乙酰化试纸的制备：将层析用滤纸裁成5 cm×20 cm纸条，浸入盛有300 mL苯、260 mL醋酸酐和0.2 mL浓H：SO。的层析缸中，不断搅拌4 h后，过夜，取出纸条在通风橱内晾干，用蒸馏水洗2-13次晾干后，放人无水乙醇中浸泡4 h，取出晾干压平。
4.样品前处理
①称取样品50 g于三角烧瓶中，加95％乙醇100 mL，KOH 12 g，装上冷凝管，于水浴(95℃)加热回流3 h，取下三角烧瓶，样液滤入装有100 mL水的分液漏斗中。
②依次用乙醇50 mL、环己烷150 mL分两次洗三角烧瓶，过滤后一并收于分液漏斗中，振摇3 min，静置分层，下层液放于第二只分液漏斗中，再用环己烷70 mL提取3 min，分层后，弃水层。
③环己烷提取液合并于第一只分液漏斗中，用环己烷8 mL，淋洗漏斗，洗液一并收入。用40℃100 mL水洗环己烷提取液3次，水洗液合并于第二只分液漏斗中，用环己烷30 mL提取1次，振摇1 min，分层后弃水层。再用40℃水50 mL重复一次。
④全部环己烷提取液经层析柱纯化，用100 mL苯淋洗层析柱，流速2 mL／min。洗脱液用K—D浓缩器浓缩至0.1-10.5 mL，待检。
5.纸层析
①点样：在乙酰化滤纸一端5 cm处，用铅笔划一横线，用微量注射器吸取样品浓缩液(10-150／uL)，同时点B(a)P标准溶液(1ug·mL-1)20uL。
②展开：将点样后的乙酰化纸上端挂在圆柱形层析缸缸盖的挂钩上，层析缸内加30 mL无水乙醇、5 mL二氯甲烷为展开剂，纸的下端浸入溶剂约l cm，在避光处展开，待展开剂前沿上升到距纸顶l cm时取出晾干。重复操作2~3次。
③紫外灯下照射：取展开后的乙酰化纸于紫外灯(波长365 nm)下照射，用铅笔圈出B(a)P标准点相应位置的荧光带，用剪刀剪下圈内的这一部分，并剪成小碎片，放人具塞小试管中，准确加5 mL苯，盖紧后于60℃水浴加热20 min，在其间摇匀2次，冷却待检。
6.荧光测定
①定性分析：将检测液移人石英杯中，置于荧光分光光度计上，调节仪器参数，将激发波长固定在386 nm，对检测液和标准液分别在发射波长400~500 nm间扫描，绘出发射光谱图(图20—5)，再将发射波长固定在405 nm，激发波长于250~400 Flm间扫描，绘出激发光谱图(图20一6)。如两者图谱相同，就确认为苯并(a)芘。
②定量分析：将激发波长固定在386 13.m，分别测定405 nm、400 nm、410 nm处测定液和标准液的荧光强度，然后用基线法求出在405 nm处的峰高值LI = I405-1/2(I400+I410)，利用定点直线比较法计算测定样品中B(a)P含量。
Y = I1/I0×Y0×1000/m
式中：Y——待检液B(a)P含量，μg/kg；
Y0——标准液B(a)P含量，μg/kg；
I1——检测液的荧光强度；
m——样品质量，g。
7.说明
①熟肉制品试样处理应先加水30 mL和KOH 12 g，放置30 min后再加乙醇100 ml。
②用40℃温水洗环己烷提取液时，第一次轻摇15次，第二次轻摇30次，最后振摇1 min，避免剧烈振摇，防止乳化。
③层析柱下端放少量脱脂棉，先装入10 g硅胶，后装3 g中性A120。，装时注意使装好的柱中没有气泡。层析柱中也可填人硅镁型吸附剂(60-1100目)。该试剂处理参照黄曲霉毒素检测的高效液相色谱法。
④于脂肪提取器中放人脱脂药棉，用环己烷浸泡，在水浴上经抽提4h以上，取出晾干。
⑤也可采用薄层层析法来检测。在硅胶G薄层板上点不同系列标准液与待测液，然后用异辛烷展开3次，取出，在暗处稍晾干，置紫外光灯下(波长365 nm)观察，分别划出所有荧光部分，再分别刮下后各加95％乙醇5 mL，振摇离心后，分别取上清液于荧光分光光度计下，用激发波长386 nm检测，标准系列根据荧光波长406 nm处测得的峰高值，绘制标准曲线，样液根据荧光波长406 nm处的峰高值，从标准曲线查得苯并(a)芘的含量。
