1.前言
海水无机氮是海洋植物生长所必须的营养元素。但当其含量过高时，与水中其它营养盐类共同作用便可能引起水体富营养化。而富营养化的水体，水生植物便会大量繁殖，消耗水中的溶解氧，破坏海洋生态环境，进而引发赤潮,造成海洋灾难。尽管赤潮的形成是多种环境因素的共同作用，但营养盐是导致赤潮发生的物质基础[1]。海水的富营养化和适宜的营养盐结构是引发赤潮的主要因素。解决赤潮的根本途径是减少沿海工业、生活污水的排放，但短期内这一目标难以达到，只能加强对赤潮的预报。由于赤潮的发生与营养盐存在着密切关系，海水营养盐的监测便尤为重要。无机氮（包氨氮、硝氮、亚硝氮）是海水营养盐监测中的重要项目。因此海水无机氮测定方法的研究对海洋环境监测具有重要意义。
氨氮是水环境质量监测的主要指标之一。测定水环境中氨氮的含量对控制水环境质量有着非常重要的意义。氨氮的传统测定方法主要有纳氏试剂分光光度法、次溴酸钠氧化法、靛酚蓝分光光度法[2]。
2.材料和方法
2.1海水样品
海水样品的采集按照《GB 12763.4-2007海洋调查规范 海水化学要素观测》的要求进行。海水水样采自中国近海。
2.2传统方法的测定
亚硝酸盐采用萘乙二胺分光光度法测定。硝酸盐采用镉柱还原法测定。氨采用靛酚蓝分光光度法。以上方法均为《GB 17378.4-2007海洋监测规范 第四部分：海水分析》中测定氨、硝酸盐、亚硝酸盐的仲裁方法。
2.3流动注射分析仪测定
采用《近岸海域环境监测规范 HJ 442-2008》附录G和附录H中的流动注射自动光度法分别测定海水水样中的氨、硝酸盐、亚硝酸盐。
3.实验部分
3.1萘乙二胺分光光度法测定亚硝态氮[11]
3.1.1仪器工具
风光光度计、容量瓶、量筒、25ml比色管、烧杯、棕色试剂瓶、聚乙烯洗瓶、移液管、吸气球、玻璃棒、天平
3.1.2主要化学试剂
磺胺、盐酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠
3.2.3溶液的配制
磺胺溶液（10g/L）:称取1.0g磺胺溶于70ml盐酸溶液（1+6），用水稀释至100ml，盛于棕色试剂瓶中。
盐酸萘乙二胺溶液（1.0g /L）:称取0.1g盐酸萘乙二胺，溶于100ml水中，盛于棕色试剂瓶中。
3.1.3分析步骤
先绘制标准曲线，取7个25ml具塞比色管，分别移入0、0.25ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml亚硝酸盐标准使用溶液，加水至标线，混匀。各加入1.0ml磺胺溶液，混匀，放置5min后再各加入1.0ml盐酸萘乙二胺溶液，混匀，放置15min。选543nm波长，使用1cm比色皿，以水做参比测定吸光值Ai。水样的测定步骤与标准曲线测定步骤相同。
3.2镉柱还原法测定硝态氮[12]
3.2.1仪器工具
风光光度计、容量瓶、量筒、锥形分液漏斗、50ml比色管、烧杯、棕色试剂瓶、聚乙烯洗瓶、移液管、吸气球、玻璃棒、天平、PH试纸
3.2.2主要化学试剂
碘胺、盐酸、盐酸萘乙二胺、硝酸钾、氯化铵
3.2.3溶液配制
氯化铵缓冲溶液：称取10g氯化铵溶于1000ml水中，用约1.5ml氨水调节PH至8.5。
磺胺溶液（10g/L）:称取1.0g磺胺溶于70ml盐酸溶液（1+6），用水稀释至100ml，盛于棕色试剂瓶中。
盐酸萘乙二胺溶液（1.0g /L）:称取0.1g盐酸萘乙二胺，溶于100ml水中，盛于棕色试剂瓶中。
3.2.4分析步骤
先绘制标准曲线，取7个100ml比色管，分别加入0、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml硝酸盐标准使用溶液，加水至50ml至标线，混匀。各加入50ml氯化铵缓冲溶液，混匀。将混合溶液逐个倒入还原柱中约30ml，直至溶液接近镉屑上部界面，弃去流出液，重复上述操作，接取25ml流出液于50ml比色管中，用水稀释至50ml，混匀。各加入1.0ml磺胺溶液，混匀，放置2min。再各加入1.0ml盐酸萘乙二胺溶液，混匀，放置20min。在543 nm波长下使用1cm比色皿，以水做参比测定吸光值Ai。水样的测定步骤与标准曲线测定步骤相同。
3.3 靛酚蓝分光光度法测定氨[13]
3.3.1仪器工具
风光光度计、容量瓶、量筒、锥形分液漏斗、 25ml比色管、烧杯、棕色试剂瓶、聚乙烯洗瓶、移液管、吸气球、玻璃棒、天平、电热炉
3.3.2主要化学试剂
柠檬酸钠、氢氧化钠、苯酚、亚硝酰铁氰化钠、硫代硫酸钠、碳酸钠、次氯酸钠溶液
3.3.3溶液的配制
柠檬酸钠溶液（480g/L）:称取240g柠檬酸钠，溶于500ml水中，加入20ml氢氧化钠溶液，加入防爆沸石，煮沸除氨，至溶液体积小于500ml。冷却后用水稀释至500ml，盛于聚乙烯瓶中。
氢氧化钠溶液：称取10g氢氧化钠，溶于1000ml水中，加热蒸发至500ml，置于聚乙烯瓶中。
苯酚溶液：称取1.9g苯酚和20mg呀硝酰基铁氰化钠溶于少量水中，稀释至1000ml，混匀，盛于棕色试剂瓶中。
次氯酸钠使用溶液：用氢氧化钠使用溶液稀释一定量的次氯酸钠溶液，使其1.0ml 中含1.5g有效氯。
硫代硫酸钠溶液：称取25g硫代硫酸钠，溶于少量水中，稀释至1000ml，加1g碳酸钠，混匀。置于棕色瓶中。
3.3.4分析步骤
先绘制标准曲线，取6个25ml比色管，分别加入0、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml铵标准使用溶液，加水至标线，混匀。各加入1.0ml柠檬酸钠溶液，混匀。再加入1.0ml苯酚溶液，混匀。再加入1.0ml次氯酸钠使用溶液，混匀，放置6h以上，在640nm波长下，使用3cm比色皿，以水做参比测定吸光值Ai。水样的测定步骤与标准曲线测定步骤相同。
3.4流动注射自动光度法测定硝态氮和亚硝态氮
3.4.1仪器工具
QUAATRO流动注射仪、镉还原柱、容量瓶、量筒、比色管、烧杯、棕色试剂瓶、聚乙烯洗瓶、移液管、吸气球、玻璃棒、天平、样品杯
3.4.2主要化学试剂
磺胺、磺胺、盐酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠、硝酸钾、Brij表面活性剂、硫酸铜
3.4.3 溶液的配制
磺胺储备溶液：溶解10.0g磺胺至1L10%的盐酸溶液中。
硝酸盐储备溶液（100mg N/L）：在1L的容量瓶中预先加800ml纯水，溶解0.7217g亚硝酸钠，用纯水稀释至标线，用聚乙烯瓶储存。
亚硝酸盐储备溶液（100mg N/L）：在1L的容量瓶中预先加800ml纯水，溶解0.4928g亚硝酸钠，用纯水稀释至标线，用聚乙烯瓶储存。
Brij-35初始溶液：在1000ml纯水中加入2ml Brij表面活性剂。
磺胺溶液：取200ml磺胺储备液加入1ml Brij-35溶液。
盐酸萘乙二胺溶液：将1.0g盐酸萘乙二胺溶于1L纯水中。
硫酸铜溶液：将20g硫酸铜溶解于1L纯水中。
3.4.4分析步骤
测定前，冰冻的样品先在室温下解冻，配制好所有的试剂和标准溶液。开启QUAATRO流动注射仪，预热30min。根据分析亚硝酸盐或硝酸盐的类型设置分析通道，设置分光光度计的波长为550nm。根据样品中亚硝酸盐或硝酸盐最高浓度设定合适量程。加入试剂到进样通道，直至基线稳定。准备好干净的样品杯，将标准曲线系列溶液、分析的样品、实验室试剂空白、实验室基体加标样和质控样分别放置进样盘内进行分析测定。分析结束后，泵入纯水清洗所有试剂管路。
3.5流动注射自动光度法测定氨氮
3.5.1仪器工具
容量瓶、比色管、烧杯、棕色试剂瓶、聚乙烯洗瓶、移液管、吸气球、玻璃棒、天平、样品杯、QUAATRO流动注射仪
3.5.2主要化学试剂
柠檬酸钠、氢氧化钠、乙二胺四乙酸、硫酸铵、氯仿、亚硝酰铁氰化钠、苯酚、二氯异氰脲酸钠盐
3.5.3溶液配制
络合剂储备液：溶解140g二水合柠檬酸钠、5.0g氢氧化钠、10.0g乙二胺四乙酸至800ml纯水中，混匀，稀释至1L。
硫酸铵储备液（100mlN/L）：称量0.4721g硫酸铵，转移至含800ml纯水的容量瓶中，溶解后加几滴氯仿，定容至1L，置于玻璃瓶中。
亚硝酰铁氰化钠溶液：溶解0.25g亚硝酰铁氰化钠于400ml纯水中，稀释至500ml，置于棕色瓶中。
苯酚溶液：溶解1.8g固体苯酚和1.5g氢氧化钠于1L水中。
次氯酸钠溶液：溶解0.5g氢氧化钠和0.2g二氯异氰脲酸钠盐于1L纯水中。
3.5.4分析步骤
测定前，冰冻的样品先在室温下解冻，准备好所有的试剂和标准溶液。开启QUAATRO流动注射仪，预热30min。调整分析流程和泵管，调整分光光度计的波长为660nm，打开灯。选择合适的载流，泵入纯水至基线稳定后，加入试剂到进样通道，直至试剂基线稳定。准备好干净的样品杯，将标准曲线系列溶液、分析的样品、实验室试剂空白、实验室基体加标样和质控样分别放入进样盘内进行分析测定。分析结束后，泵入纯水清洗所有试剂管路。
以上所用试剂均为分析纯，水为去离子水。
4.计算
4.1An的计算
An=Ai-A0,Ai为风光光度计测定的空白以外的吸光值，A0为空白的吸光值。
4.2样品浓度的计算
传统方法中的计算均利用Excel软件。萘乙二胺分光光度法和靛酚蓝分光光度法的计算利用过程中标准曲线的绘制均以扣除空白后的吸光值为横坐标，浓度为纵坐标,得到线性回归方程c(mg/L)=aAn+b，c为样品的浓度，An为扣除空白后的吸光值，a为标准曲线斜率，b为标准曲线截距。将样品所测的吸光值，扣除空白后带入上述线性回归方程，即可得到样品浓度。镉柱还原法的计算过程中得到的线性回归方程为c总(mg/L)=aAn+b， c总为亚硝酸盐和硝酸盐的总浓度，An为扣除空白后的吸光值，a为标准曲线斜率，b为标准曲线截距。因此将样品所测的吸光值，扣除空白后带入线性回归方程，得到的是亚硝酸盐和硝酸盐的总浓度。
流动注射自动光度法样品浓度的计算通过标准曲线的回归方程求得，其中标准系列点的浓度为自变量，相关的响应峰值为应变量。
4.3样品加标回收率的计算
取相同的两份样品，其中一份加入定量的待测成分标准物质。两份同时按相同的分析步骤分析，加标的一份所得的结果减去未加标一份所得的结果，其差值同加入标准物质的理论值之比即为样品加标回收率。加标回收率测定是实验室用以自控的一种质量控制技术。
加标回收率的公式为p=（C2×V2 - C1×V1）/(C0×V0)×100%。其中p为加标回收率，C2加标样的浓度，C1为未加标样的浓度，V2为加标后的体积，v1未加标样的体积。C0为所加标准溶液的浓度，V0为所加标准溶液的体积。
4.4不同方法样品所测浓度相对偏差的计算
不同方法样品所测浓度相对偏差的简化公式为d=（C2-C1）/(C2+C1)*100%。C1,C2为两种不同方法所测的样品浓度。
5.结果
5.1萘乙二胺分光光度法测定亚硝酸盐
5.1.1亚硝酸盐加标回收率
利用加标回收率公式p=（C2×V2-C1×V1）/(C0×V0)×100%进行计算，得到各个加标回收率值。结果如表1-1所示。
表1-1亚硝酸盐加标回收率 form 1-1 spiked recoveries of nitrite
5.2镉柱还原法测定硝酸盐
5.2.1硝酸盐加标回收率
利用加标回收率公式p=（C2×V2-C1×V1）/(C0×V0)×100%进行计算，得到各个加标回收率值，结果如表1-2所示。
表1-2硝酸盐加标回收率 form 1-2 spiked recoveries of nitrate
5.3靛酚蓝分光光度法测定氨氮
5.3.1氨氮加标回收率
利用加标回收率公式p=（C2×V2-C1×V1）/(C0×V0)×100%进行计算，得到各个加标回收率值，结果如表1-3所示。
表1-3氨氮加标回收率 form 1-3 spiked recoveries of ammonia
5.4流动注射自动光度法测定氨氮
流动注射自动光度法测定氨氮加标回收率结果如表1-4所示。
表1-4 氨氮加标回收率 form 1-4 spiked recoveries of ammonia
5.5流动注射自动光度法测定硝酸盐
流动注射自动光度法测定的硝酸盐加标回收率结果如表1-5所示。
表1-5 硝酸盐加标回收率 form 1-5 spiked recoveries of nitrate
5.6流动注射自动光度法测定亚硝酸盐
流动注射自动光度法测定的亚硝氮加标回收率结果如表1-6所示。
表1-6亚硝氮加标回收率 form 1-6 spiked recoveries of nitrite
6.1流动注射自动光度法与传统手工法方法的比较
6.1.1流动注射自动光度法与传统手工法方法原理的比较
流动注射自动光度法与传统手工法方法原理的比较如表2-1所示。
表2-1方法原理的比较 form 2-1 comparative of principle
6.1.2流动注射自动光度法与传统手工法方法比色波长的比较
流动注射自动光度法与传统手工法方法比色波长的比较如表2-2所示。
表2-2比色波长的比较 form 2-2 comparative of wavelength
6.1.3流动注射自动光度法与传统手工法方法加标回收率的比较
为了验证各个实验测定结果的准确性及对不同方法的准确性进行比较，进行了加标回收率实验。
萘乙二胺分光光度法测定亚硝酸盐的加标回收率如表1-1所示，分别为98.2%、104%、102%、97.4%、97.8%、97.8%，回收率范围为97.7%—102%。回收率值都在允许范围之内。从回收率可以看出实验结果的准确度还是很高的。流动注射自动光度法中，亚硝酸盐的回收率如表1-6所示，分别为93.8%、93.0%、93.8%、92.5%、93.6%，回收率范围为92.5%—93.8%。回收率值同样都在允许范围之内。通过比较可以看出，两种方法测定的结果准确度都很高。
镉柱还原法测定硝酸盐的加标回收率如表1-2所示，分别为110%、108%、110%、95.3%、102%，回收率范围为95.3%—110%。回收率值都在允许范围之内。流动注射自动光度法测定硝酸盐的回收率如表1-5所示，分别为104%、105%、110%、109%、110%，回收率范围为104%—110%,均在允许范围之内。通过比较，可以看出两种方法都有较高的准确度。
靛酚蓝分光光度法测定氨氮的加标回收率如表1-3所示，分别为109%、110%、89.2%、88.4%、80.0%、110%，回收率范围为80.0%—110%。流动注射自动光度法中氨氮的回收率如表1-4所示，为80.5%、84.7%、90.0%、97.0%、97.5%、104%，回收率范围为80.5%—104%，在允许范围之内。通过比较可以看出两种方法都有较高的准确度。
6.1.4流动注射自动光度法与传统手工法方法测定结果的比较
镉柱还原法与流动注射自动光度法测定硝酸盐的结果以及相对偏差如表2-4所示。
表2-4硝酸盐测定结果及相对偏差
form 2-4 measured results of nitrate and the relative deviation
表2-4中可以看出，镉柱还原法所测的结果与流动注射自动光度法所测的结果基本相近，镉柱还原法与流动注射自动光度法测定硝酸盐的相对偏差为0.50%-6.92%，结果表明两种方法没有明显差异。
靛酚蓝分光光度法与流动注射自动光度法测定氨氮的结果以及相对偏差如表2-5所示。
表2-5氨氮的测定结果以及相对偏差
form 2-5 measured results of ammonia and the relative deviation
从表2-5可以看出，靛酚蓝分光光度法所测的结果与流动注射自动光度法测定的结果基本相近，两种方法测定结果的相对偏差为5.88%—10.7%。结果表明两种方法没有明显差异。
萘乙二胺分光光度法与流动注射自动光度法测定亚硝酸盐的结果以及相对偏差如表2-3所示。
从表2-3可以看出，两种方法测定的亚硝酸盐浓度相近，相对偏差为0—11.1%，两种方法所测的结果没有明显差异。流动注射自动光度法在测定海水亚硝酸盐时可靠性是很高的。
6.2与其他类似实验的比较
吴金苗在《水环境中亚硝酸盐氮、氨氮及铁（Ⅲ）自动分析方法研究》的研究中，同样进行了流动注射法与国标法的比较实验，其得出的结果是亚硝酸盐的相对偏差在5%以下。氨氮的相对偏差在8%以下。5个样品中流动注射法所测的氨氮浓度4个高于国标法，一个低于国标法[9]。本次实验的结果与其相似，流动注射法与国标法的比较,亚硝酸盐的相对偏差在5%左右。氨氮的相对偏差在8%左右。
表2-3亚硝酸盐测定结果及相对偏差
form 2-3 measured results of nitrite and the relative deviation
7.总结
本次实验采用流动注射自动光度法与国家标准中的仲裁方法分别测定不同区域的海水样品中的氨氮、硝氮、亚硝氮的浓度。通过方法原理、比色波长、样品加标回收率、测定结果相对偏差对两种方法进行比较研究。从方法原理和比色波长的来看，两类方法不存在太大差别。从样品测定结果的相对偏差来看，传统手工方法与流动注射自动光度法的测定结果基本相近，不存在明显的差异。说明流动注射自动光度法不但在测定淡水无机氮时是可靠的，在测定海水无机氮时准确度也是很高的。从加标回收率来看，传统手工方法和流动注射自动光度法的加标回收率都在允许范围之内，表明传统手工方法和流动注射自动光度法测定海水无机氮结果准确度都是较高的。
总的来说，流动注射自动光度法测定海水无机氮具有较高的可靠性。与传统方法相比，其测定结果也没有明显的差异，此外流动注射自动光度法在测定大量样品时具有很大的优势，不仅操作简单而且测定速度快，能节省大量时间。流动注射自动光度法完全可以替代手工方法测定海水无机氮。
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[10] 近岸海域环境监测规范 HJ 附录G 附录H 442-2008:46-54.
[11] 中华人民共和国国家标准.海洋监测规范第四部分:海水分析GB 17378.4-2007:113-115.
[12] 中华人民共和国国家标准.海洋监测规范第四部分:海水分析GB 17378.4-2007:115-117.
[13] 中华人民共和国国家标准.海洋监测规范第四部分:海水分析GB 17378.4-2007:109-110.
