胆固醇是食品中的重要组分之一，准确地测定奶粉样品中的胆固醇含量对指导婴儿或中老年人的健康膳食具有重要意义。食品样品中的胆固醇气相色谱法测定通常采用GB9695.24-2008方法，但在实际操作中该法存在操作繁琐、有机溶剂消耗大、样品的测定结果重复性较差等缺点。本实验通过校测不同脂肪含量对奶粉中胆固醇测定的影响，从而对奶粉样品的胆固醇气相色谱外标法测定作了改进，完善了此类样品的检测过程，得到满意的结果。
一、材料与方法
1.试剂与设备
乙醚(分析纯)、石油醚(分析纯)，氯化钠溶液(100g/L)。KOH-乙醇溶液(1mol/L):称量12gKOH(分析纯)，加入200mL无水乙醇搅拌混匀充分溶解，冷却后装入广口塑料瓶内，然后放入冰箱以4℃储存，最后取其上层澄清溶液使用。脂肪基底溶液(0.1g/mL):取市售猪油，准确称量10g，以氯仿充分溶解移入100mL容量瓶，再以氯仿定容至刻度。
设备包括具塞量筒、回流皂化器、恒温水浴锅、分析天平、HP6890 Plus气相色谱仪等。
2.实验方法
(1)奶粉样品的脂肪提取
奶粉样品中的脂肪提取采用哥特罗-罗紫法(参照GB5009.46-2003)，本实验检测了两种奶粉样品，即已充分混合均匀的低脂、全脂奶粉。首先测定样品的脂肪比例，根据样品的脂肪含量不同脱脂奶粉称取2.0g，全脂奶粉称取1.0g左右。全量提取后的石油醚-乙醚溶液取45mL，待溶剂旋转挥发干燥称重后分别显示提取出脂肪量约0.1g(低脂奶粉)、0.4g(高脂奶粉)。需要检测胆固醇的样品提取液在旋转瓶挥发完毕后无需转移，直接进入下一步皂化程序。
(2)皂化
在每个皂化瓶中加入1mol/L的KOH-乙醇溶液皂化液5mL，混匀后，90℃恒温回流皂化1h，取下稍混匀数次，将皂化液转移至20mL比色管内，加1mL100g/L的氯化钠溶液于皂化瓶中充分溶解未完全转移的皂化液体，再加4mL氯化钠溶液于皂化瓶震荡全量转移至20mL比色管中，凉水冷却。
(3)提取
在每个比色管中加入5mL石油醚，密闭管口剧烈震荡5min，静置分层30min后待检。
(4)绘制胆固醇工作曲线
根据样品提取出的脂肪量分别制作相应的工作曲线，在工作曲线各点加入与样品基体相当的脂肪基体，本实验针对低脂、高脂奶粉样品分别制作工作曲线1与工作曲线2(见图1)。工作曲线1:取5只皂化瓶，各加入自行配制的脂肪基体溶液0.1mL，再分别加入胆固醇标准溶液0mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL旋转蒸发吹干，则每点加入的脂肪为0.1g，仿照样品皂化处理，该工作曲线适用于低脂奶粉样品的检测。工作曲线2各点加入脂肪基体溶液0.4mL，余同前，该曲线适用于高脂奶粉样品检测。
<CTSM>图1不同奶粉胆固醇检测工作曲线对比</CTSM>
(5)色谱条件
HP6890 Plus气相色谱仪，FID检测器。进样口温度为300℃，检测器温度为300℃。大口径毛细柱OV-101，15m×0.53mm×1.0μm(在其他一些相关研究中用HP-1大口径毛细柱，本方法采用极性常数相当的101柱)。升温程序:初始温度为150℃，以30℃/min的速度升至260℃，保持4min。载气流速为10mL/min，进样量为1.0μL，分流进样，分流比为1:1，样品出峰时间为7.07min。
二、结果与讨论
1.实验条件优化
对实验中所需氯化钠溶液与石油醚用量进行考察。分别比较了两种不同浓度氯化钠溶液(50g/L与100g/L)对萃取效率的影响，结果表明对同一个样品其萃取效果是一致的。此外，分别比较了5mL、10mL、15mL不同体积的石油醚萃取效果，以10mL石油醚萃取无论是在萃取后体积的稳定方面还是在保证样品中胆固醇的定量检出方面均表现较好，因此，本实验选择萃取时氯化钠溶液浓度为100g/L、石油醚体积为10mL。
2.标准谱图、准确度、检出限与线性范围
胆固醇标准色谱峰如图2所示，胆固醇峰形对称，其保留时间与峰面积的重现性良好。采用程序升温改善了胆固醇的峰形，节约了样品检测时间。
<CTSM>图2胆固醇标准谱图</CTSM>
由于胆固醇为高沸点物质，在低浓度情况下其峰形变宽，不利于准确地积分。为确定最低检出浓度，逐级稀释配制不同浓度的胆固醇标准溶液进样表明，在当前的实验条件下，可以检出的最低浓度为0.01mg/mL，按1μL进样水平其最低检测量为0.01g(3S/N)，如以取样量2g计算，则样品最低检测含量为25mg/kg。在(0.02～1.0)mg/mL之间曲线线性良好，两条工作曲线如图1所示，由图可见两曲线的斜率完全不同。低脂奶粉的斜率高于高脂奶粉的斜率，由此可知若仅以一种曲线来定量不同的奶粉胆固醇含量必将引入明显的测定误差。
3.检测结果及加标回收实验
对同一批次的低脂与高脂奶粉进行的样品检测结果如表1所示。
<CTSM>表1不同脂肪含量奶粉样品胆固醇检测一览表</CTSM>
本实验同时对高脂奶粉样品开展了回收实验，加标量为0.0896mg胆固醇，实验结果如表2所示。
<CTSM>表2高脂奶粉胆固醇加标回收实验结果一览表</CTSM>
三、小结
为准确地检测奶粉中的胆固醇，先决条件是必须准确地提取奶粉中的所有脂肪含量。有人以索氏抽提器来提取奶粉中的脂肪，然而实验证明这种提取方法并不能完全将奶粉中的脂肪完全提取出来。这是因为奶粉中的脂肪有相当一部分是结合在酪蛋白中的，需要以碱性条件将其游离出来。
一直以来，常规奶粉样品的胆固醇含量测定一直采用分光光度法或气相色谱测定方法GB9695.24-2008。但以这些方法检测实际食品样品时遇到的主要问题是，不同脂肪量与不同取样量导致的检测结果不平行。多次实验表明，提取用石油醚液体的体积，或是氯化钠溶液的浓度，对同一批样品定量均没有明显的影响，但是皂化时脂肪的量对萃取效率产生了明显作用，这可能是因为在石油醚萃取时脂肪皂化液的基体不同，对胆固醇在两相间分配系数产生不同影响造成的。实验表明，石油醚对脂肪较多的皂化液提取效率明显降低，因此对样品的精确定量产生了较大的影响。在实验中，将不同脂肪含量的样品分组是解决这个问题的较好办法。将此类样品分别归组，并尽量控制好原始样品的称重，控制其脂肪提取物的重量在此范围内。实验结果显示，按此方法制作的工作曲线在不同检测日检测结果比较稳定。
