淀粉酶包括几种催化特点不同的成员，其中α-淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等糖类，同时使淀粉浆的黏度下降，因此又称为液化酶；β-淀粉酶每次从淀粉的非还原端切下1分子麦芽糖，又被称为糖化酶。几乎所有植物中都存在有淀粉酶，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活力最强。淀粉酶在食品、制酒和制药等工业中有广泛应用[1]。本文通过测定小麦种子不同萌发阶段的淀粉酶活力，寻找α-淀粉酶和β-淀粉酶的最适宜提取时期，并进一步研究不同化学环境对2种淀粉酶活力的影响，以提高淀粉酶在工业领域的利用效率。
1材料与方法
1.1试验材料供试材料：小麦种子，品种为河北9411，由天津玮达生物公司提供。供试仪器为恒温培养箱、721E型分光光度计、恒温水浴锅、800型台式低速离心机。试验水为蒸馏水。碘贮存液：于约400mL蒸馏水中溶解1.7835g碘酸钾、22.5g碘化钾，缓缓加人4.5mL浓盐酸，边加边搅拌，再用蒸馏水稀释至500mL，充分混匀，贮棕色瓶于冰箱内保存[2]。碘应用液：贮存液50倍稀释，置冰箱内可用1个月。1％淀粉：称取10g可溶性淀粉，加入约50mL蒸馏水使之成糊状后倒入500mL沸腾的蒸馏水中，再用蒸馏水洗净小烧杯内淀粉，至少2次，冷至室温后用蒸馏水稀释至1L，于冰箱内保存。缓冲液：0.1moL/LpH值为5.6的柠檬酸缓冲液（每20mL缓冲液中含0.1moL/L柠檬酸5.5mL和0.1moL/L柠檬酸钠14.5mL）。0.1moL/LH2SO4，硫酸钠、硫酸铜、氯化钙、氯化铝各0.5moL/L。以上试剂不加说明者，均为分析纯。
1.2样品制备方法
1.2.1小麦种子的培养。供试小麦种子经蒸馏水漂洗浮选后，用3倍体积的蒸馏水浸泡，25℃恒温培养箱放置24h后，转移至铺有纱布的培养皿中，置于25℃恒温培养箱中，每天按时加水。
1.2.2淀粉酶液的制备。称取4g小麦种子，置于研钵中，加入少量石英砂和10mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分2次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15~20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。淀粉酶原液经过70℃水浴15min钝化β-淀粉酶[3]后，用于α-淀粉酶活力测定。吸取上述淀粉酶原液5mL，放入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。
1.3淀粉酶活力测定方法
在Yoo改良法[4]基础上略有改动。准确吸取1mL相应酶液（对照管准确吸取1mL蒸馏水），置于比色管中，加入0.1moL/LpH值为5.6的柠檬酸缓冲液4mL摇匀，于40℃水浴预热5min，准确加入1％可溶性淀粉溶液(40℃水浴预热)1mL，立即计时，摇匀，于40℃水浴准确保温酶解反应5min后，加0.1moL/L的H2SO45mL终止反应。取0.5mL反应液加入2mL碘应用液显色，再加入3.5mL蒸馏水摇匀，以2mL碘应用液加入4mL蒸馏水为空白，在1cm比色皿、620nm波长下测吸光度。1个酶活力单位（U）定义为1g鲜重种子中的淀粉酶40℃5min内水解10mg淀粉的酶量。淀粉酶活力按以下公式计算[5-6]：
淀粉酶活力=[（AB-AU）/AB]×酶液总体积/4
α-淀粉酶活力=25×（AB-AU）/AB
总淀粉酶活力=500×（AB-AU）/AB
β-淀粉酶活力＝总淀粉酶活力-α-淀粉酶活力
上式中：AB为对照管吸光度，AU为测定管吸光度。
2结果与分析
2.1萌发时间对2种淀粉酶活力的影响。由表1可知，2种淀粉酶在萌发过程中活力的变化趋势决定了α-淀粉酶活力占总酶活力的比例在萌发前期迅速升高，在萌发3d达到最高值后缓慢下降，而β-淀粉酶活力占总酶活力的比例在萌发前期先缓慢下降，在萌发3d达到最低值后再缓慢上升。在总淀粉酶活力中β-淀粉酶活力占据了绝大部分，在萌发过程中α-淀粉酶活力占总酶活力的比例最高时只有6.17%。为尽可能多的获得α-淀粉酶，应选择萌发3d的小麦种子进行提取。其变化趋势如图1所示。由图1可知，小麦种子在浸泡之前的休眠状态中2种淀粉酶均具有一定的活力，其中α-淀粉酶活力比较微弱，而β-淀粉酶活力较为明显。浸泡24h后，β-淀粉酶活力表现出了明显的下降。从萌发后1d开始2种淀粉酶活力均稳步增长，其中α-淀粉酶活力增长迅速，并在萌发的3d活力达到最大，随后α-淀粉酶活力开始缓慢下降。与α-淀粉酶相比，β-淀粉酶活力增长比较平缓且在测定时间范围内始终保持增长，但从萌发5d开始增速放缓。
2.2化学环境对2种淀粉酶活力的影响。取萌发3d的小麦种子按1.2.2方法制备酶液。选择硫酸钠、硫酸铜、氯化钙和氯化铝等4种常见的盐类，分别配制成0.5moL/L溶液。在使用1.3方法测定酶活力的过程中，于40℃水浴预热前移取不同体积的不同盐类加入到反应体系中摇匀，加盐量如表2所示，不足2mL部分用蒸馏水补齐，对照管相应地加入2mL蒸馏水。计算α-淀粉酶活力和β-淀粉酶活力后，以不加盐时的酶活力为100%换算成相对酶活力，结果见表2。
由表2可知，在测定范围内氯化钙对β-淀粉酶活力有一定促进作用，加盐量为0.3mL时促进作用最强，酶活力可达无盐时的128.93%，该加盐量下氯化钙对α-淀粉酶活力也表现为促进，酶活力可达无盐时的102.90%。但随着加盐量增加，氯化钙对α-淀粉酶活力表现出缓慢增强的抑制作用。硫酸钠对2种淀粉酶活力的影响都不大，在相同加盐量下，α-淀粉酶受到的影响略大于β-淀粉酶。硫酸铜和氯化
铝对2种淀粉酶活力都表现出了很强的抑制作用，在低加盐量下抑制作用就十分明显，其中加硫酸铜量为0.3mL时的β-淀粉酶活力只有无盐时的67.67%，且随着加盐量提高，抑制作用不断增强。硫酸铜对2种淀粉酶的抑制作用要强于氯化铝，在一定加盐量范围内β-淀粉酶活力受到硫酸铜和氯化铝的抑制作用要强于α-淀粉酶。
3结论与讨论
试验结果表明，小麦种子在浸泡之前的休眠状态中2种淀粉酶均具有一定活力，其中α-淀粉酶活力比较微弱而β-淀粉酶活力较为明显。萌发后2种淀粉酶活力均稳步增长，α-淀粉酶活力3d达到峰值并开始下降，其占总酶活力的比例也有相同趋势，最高时达6.17％。为尽可能多的获得α-淀粉酶，应选择萌发3d的小麦种子进行提取[6-12]。β-淀粉酶活力始终保持增长。
化学环境变化方面，在测定范围内氯化钙对β-淀粉酶活力有一定的促进作用；硫酸钠对2种淀粉酶活力的影响都不大，在相同加盐量下α-淀粉酶受到的影响略大于β-淀粉酶；硫酸铜和氯化铝对2种淀粉酶活力都表现出了很强的抑制作用，在低加盐量下抑制作用十分明显，在一定加盐量范围内β-淀粉酶活力受到硫酸铜和氯化铝的抑制作用要强于α-淀粉酶[13-14]。
