（The Inspection Technical Center of Zhuhai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhuhai 519015, China）
Abstract: Nine exogenous DNA fragement were selected as target genes, their primers and probes were designed and synthesized, then the probes were immobilized in the Thin-Film Biosensor Chips. PCR was used to amplify the target sequence in food sample DNA, then the Biochip were hybridized with PCR product, at last the chip displayed the hybridization result. The method can detect 5 kinds of common modified plant, and the method is efficient, accurate, simple, high-throughput, practical, sensitive (0.1％), and get rid of the dependence of fluorescence scanner, with good application value..
Key words: Biochip; Genetically-modified; Food; Detection
随着基因工程技术的日趋成熟及在农产品上的广泛应用，转基因食品对人和动物的健康及对生态环境的影响，已成为世界各国关注的焦点。据统计，2011年转基因作物的种植面积为1.6亿公顷，比1996年增长94倍[1]，据估计，用转基因作物生产加工的食品全世界有近万种[2]。基因工程掌握的不确定性及不可预测性,使得转基因食品安全问题成为目前人类在发展过程中必须面对的一个棘手的环境问题。[3]各国政府先后出台了相应的法律和管理办法，对转基因食品实行强制标识或自愿标识。我国于2002年7月开始实施《转基因食品卫生管理条例》，对转基因食品产品进行标识管理。目前国际上常用的转基因产品检测方法主要有酶联免疫检测（ELISA）、PCR检测、荧光定量PCR检测等技术[2]，这些方法在对含有多种转基因成分的样品进行检测时，容易漏检，通量低[4]。
基因芯片技术具有快速、准确、高通量、平行化等优点，是近年来迅速发展的一项高新生物技术[5-6]，普通基因芯片技术因为操作复杂，且需要专业的扫描仪器分析结果，限制了它在常规实验室的应用［7-11］。而本研究所用的可视芯片与传统芯片相比，它通过肉眼就可以观察到芯片杂交的信号，更有利于在基层实验室推广使用，可以广泛地在只有PCR仪之类的基本分子生物学设备的个体实验室或研究站投入使用［11］。本研究旨在建立一种快速、准确、方便、高通量的多基因芯片检测方法，并对该方法的特异性、灵敏度和重现性进行测试。
1 材料和方法
1.1 仪器
梯度PCR仪Mastercycler pro S，德国eppendorf公司；7500Fast实时荧光定量PCR仪，美国ABI 公司；高速冷冻离心机3K18型，德国Sigma公司；超纯水处理器milli-Q plus，法国密理博公司；高速离心机5430，德国eppendorf公司；电泳仪Power Pac300，美国Bio-rad公司；凝胶成像分析系统Aphaimager HP，美国Alpha公司；紫外交联仪SCIENTZ 03-Ⅱ，新芝生物科技股份有限公司；芯片点样仪Fast Spot，芯片杂交仪DR.Mini Oven，台湾晶宇生物技术有限公司。
1.2 材料和试剂
转基因水稻科丰6号，转基因水稻克螟稻，转基因玉米MON810，耐除草剂大豆MON89788，抗草甘膦转基因大豆(RRS1/GTS 40-3-2)，转基因水稻华恢1号，本实验室检测留样。
DL2000 Ladder Marker 宝生物工程（大连）有限公司；Ex Taq(DR001A) 宝生物工程（大连）有限公司；Premix Ex Taq 2× (Perfect for Real Time) 宝生物工程（大连）有限公司；GoldViewTM 核酸染料 北京赛百盛基因技术有限公司；DR.Chip DIYTM Kit 购自台湾晶宇生物技术有限公司。
1.3 引物与探针
本研究利用Primer Premier 5.0设计每段待测靶基因的备选探针，并注意使各探针的杂交动力学性质相近。长度在20~40bp间。根据芯片的反应原理，下游引物5’端以生物素标记，探针5’端标记一段polyT。引物和探针由上海英骏生物公司合成。引物和探针序列见表1。
表1引物探针汇总表
Tab. 1 primers and probes summary table
1.4 芯片的制备
筛选出的靶基因点制成重复探针检测点。以生物素标记的PolyT作为芯片质控点，以特异性序列探针作为阴性对照点，以点样液作为空白对照点。设计出芯片的矩阵。见表2。
表2 芯片阵列设计示意表
Tab. 2 Schematic chart of the oligonuclecide microarrays
将合成的探针稀释至30 pmol/μL，加入等体积的2×点样缓冲液，按照预先设计好的列阵加入探针溶液盘中，每孔加入约15 μL。按操作说明使用DR.Fast Spot点样仪点制芯片，点样完毕后目测点样区，检测是否漏点，形状是否规则。点制好的芯片室温静置5~10 min，在紫外交联仪中254nm交联700 s，加500uL超纯水冲洗5 min两次。加100 μL 95%乙醇20s后，放入50℃干燥箱中干燥10 min，4℃保存备用。
1.5 样品DNA的提取
转基因玉米MON810，转基因水稻科丰6号，转基因水稻华恢1号，抗草甘膦转基因大豆(RRS1/GTS 40-3-2)，耐除草剂大豆MON89788，转基因水稻克螟稻及其他的转基因玉米、大豆、水稻和非转基因食品的DNA均采用CTAB法提取纯化样品DNA。
1.6 样品DNA的PCR扩增
将待测样品模板DNA、引物及反应试剂按表3所示体积加入到PCR反应管中。PCR反应条件见表4。
反应结束后，取5μL扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶（含0.05μL/ml的GoldViewTM）电泳检测，电泳条件为120V，40min，用DL2000作为DNA标准分子量，紫外灯下检测电泳结果并拍照分析。
表3 PCR反应体系
Tab. 3 Reaction system of PCR experimen
表4 PCR反应条件
Tab. 4 Reaction condition of PCR experimen
1.7 芯片的杂交和结果判读
杂交：吸取1～25μL PCR扩增产物和200μL DR.HybTMBuffer混合于离心管中，100℃变性5 min，迅速冰浴5 min。把所有的杂交混合液转移到芯片凹槽中，避免产生气泡。置于45℃杂交箱中杂交45 min。
清洗：去除杂交液。加250 μL Wash Buffer到芯片凹槽中，去除洗液，重复两次。
封闭：加封闭液（0.2 μL Strep-AP与200 μL Blocking Reagent混合液）到芯片凹槽中，室温（25~35℃）反应30 min。去除封闭液，加250 μL Wash Buffer到杂交室，去除洗液，重复两次。将芯片在吸水纸上拍打，以吸出残留的洗液。
显色：加显色液(4 μL NBT/BCIP与196 μL Detection Buffer混合液)到芯片凹槽中，避光室温反应5~10 min。去除显色液，用超纯水冲洗芯片，并读取结果。
1.8 特异性试验
按照1.7所述杂交过程以靶基因为单位，分别用不同的阳性对照核酸对靶基因进行扩增后与芯片进行杂交。确认检测特异性。
1.10 灵敏度试验
利用本研究建立的可视芯片对0.01%，0.1%和0.5%阳性转基因植物标准品进行检测，确认其检测限。
1.11 重复性及稳定性实验
随即抽取不同点样批次和同一点样批次的不同芯片各3张，在相同的条件下对转基因植物标准品进行检测，验证芯片的重复性和稳定性。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增结果
17种靶基因PCR扩增产物经凝胶电泳检测，扩增效果如图1所示。
图1 17种靶基因PCR扩增
Fig.1 Amplify the 17 target sequence by PCR
M：DL2000 Ladder Marker；1：GOS；2：89788；3：CaMV35S；4：PAT；5：NOS；6：FMV35S；7：GOX；8：Lectin；9：ZEIN；10：tRNALeu；11：MON810；12：KF6；13：NPTII；14：Bar；15：Bt63；16：Cry；17：KMD
2.2 芯片检测的特异性
通过获得最佳杂交温度和杂交时间后，17个靶基因经PCR扩增后分别与检测芯片上的探针进行杂交。基因芯片杂交结果结果如图2所示，各种靶基因PCR产物均与芯片上的探针特异性结合，无交叉反应。同时该芯片上点制的空白对照、阴性对照和质控探针结果正常，形成了很好的监控体系。上述的结果可以说明本方法具有很好的特异性，可以对转基因植物进行准确检测。
PAT
图2 芯片特异性杂交
Fig.2 Microarray hybridization result of specific experiment
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
2.3灵敏度实验
采用本研究建立的方法对不同含量的转基因植物标准品进行检测。实验结果表明，基因芯片杂交检测灵敏度为0.1%。
|
|
|
|
图3芯片检测灵敏度杂交图
Fig.3 Microarray hybridization result of sensitivity experiment
2.4重复性及稳定性实验
以BT63基因为例，对3张不同点样批次和同一点样批次的3张不同芯片，在相同的条件下进行杂交试验，分析基因芯片的重复性及稳定性。杂交结果如下图，该结果显示出芯片不同点样批次之间和相同点样批次之内的芯片的重复性和稳定性好。
图4 不同点样批次杂交图
Fig.4 Microarray hybridization result of differences sample batches
|
|
|
|
图5 同一点样批次杂交图
Fig.5 Microarray hybridization result of same sample batches
|
|
|
|
3 讨论
本研究根据检验检疫日常检测工作对转基因成分的检出率的统计确定了用于生物芯片检测的3种植物（大豆、大米、玉米）。通过研究不同转基因植物的特征序列，筛选了17套引物，并分别设计了相应的探针，并建立了一种基于可视晶片体系的转基因食品检测方法，能有效的区分样品中是否存在转基因大豆、大米、玉米，该方法检测灵敏度可达到0.1%，完全满足现行的欧盟和其他国家转基因检测要求（欧盟要求农产品中含有获批准转基因成分0.9%即为转基因产品）[12]。本研究建立的检测平台能通过显色直接判读检测结果，成本低、时间短、特异性强、灵敏度高，适合食品和食品原料中转基因成分高通量检测，具有广阔的应用前景。
参考文献：
[1] 郭桦，郭祀远. 转基因食品安全性的探讨[J]. 现代食品科技，2007,8:71-73.
[2]Clive James．2011年全球生物技术／转基因作物商业化发展态势[J]．中国生物工程杂志，2012，32(1)：1-14．
[3] 黄锡生；许珂. 论我国转基因食品安全的法律完善[J]. 现代食品科技，2007,3:190-192.
[4] Livak K J, Flood S J A, Marmaro J, et al. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Meth Appl, 1995,4:357~362
[5] Bodrossy L, Sessitsch A. Oligonucleotide microarrays in microbial diagnostics[J]. Curr Opin Microbiol, 2004, 7(3): 245-254.
[6] Drobyshev A, Mologina N, Shik V, et al. Sequence analysis by hybr idization w ith oligonucleotide microchip: Identification of β- thalassemia mutat ions [J]. Gene, 1997, 188(1) : 45- 52.
[7] YE R，WANG T, BEDZYK L, et a. Applications of DNA microarrays in microbial systems[J]. J Microbiol Methods, 2001, 47: 257-272.
[8] SCHENA M. Microarray Biochip Technology[M]. Natick: Eaton Publishing, 2000: 19-63.
[9] CALL D R, BORUCHI M K, LOGE F J. Detection of bacterial pathogens in environmental samplesusing DNA microarrays[J]. Journal of Microbiological Methods, 2003, 53: 235-243.
[10] 赵金毅，白素兰，黄文圣，等. 应用可视芯片技术检测食品中常见致病菌的方法研究[J]. 分析与检测，2008，34 (8): 141-144.
[11] JENISON R, YANG S, HAEBERLI A, et al. Interferencebased detection of nucleic acid targets on optically coated silicon[J]. Nat Biotechnol, 2001, 19(1): 62-65.
[12] 李德康. 转基因食品的发展及安全性初探[J]. 科技信息, 2011, 18: 77.
