一、显色反应和显色剂
1．显色反应
有色物质本身具有明显的颜色，可直接用于光度分析，但如果被测组分的颜色很浅或没有颜色，则需加入适当的试剂使之生成有色物质，这种加入某种试剂使被测组分变成有色物质的反应称为显色反应。所加入的试剂称为显色剂。显色反应有配位反应和氧化还原反应等，其中以配位反应应用最广。对于显色反应，一般应满足下列要求：
①灵敏度高。吸光光度法一般用于微量组分的测定。显色反应的灵敏度是选择显色反应的重要指标，而显色反应的灵敏度是用有色化合物的摩尔吸光系数ε来衡量的，因此应选择生成有色物质的ε较大的显色反应，一般要求ε≥104。
②反应能定量完成。生成的有色物质组成恒定，化学性质稳定。只有组成恒定，被测组分与有色物质之间才有定量关系。
③选择性好。显色剂最好只与待测离子发生反应，其他组分不干扰或干扰易消除。
④显色清晰。生成的有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大，一般要求有色化合物的最大吸收波长和显色剂的最大吸收波长之差，应大于60nm。
2．显色剂
①无机显色剂。许多无机试剂可与金属离子显色，但多数显色反应灵敏度不高，选择性不好，而且生成的有色化合物不够稳定。因此，仅有少数无机显色剂应用于光度分析。目前应用较多的主要有硫氰酸盐、铝酸按和过氧化氢等。
②有机显色剂。许多有机试剂能与金属离子反应，生成非常稳定的有色金属螯合物。这些显色反应不仅灵敏度高，而且选择性也好。另外，许多金属螯合剂易溶于有机溶剂，可进行萃取比色，从而进一步提高了测定的灵敏度和选择性。因此，有机显色剂在吸光光度分析中得到广泛的应用。
二、影响显色反应的因素
在实际应用中，能够完全满足要求的显色反应是比较少的。因此，在初步选定显色反应之后，要认真细致地研究影响显色反应的各种因素，找出显色反应的最佳条件。
1．显色剂用量
在进行显色时，为了使显色反应尽可能进行完全，一般应加入过量的显色剂。但有些显色反应，加入过量显色剂会产生副反应，对测定不利，在这种情况下，显色剂的加入量应严格控制，使标准溶液和试样溶液生成有色化合物的组成固定。
在拟定新方法时，显色剂和其他试剂的加入量都必须通过实验确定，具体方法是：在一系列浓度相同的试液中，加入不同量的显色剂，在相同条件下分别测定其吸光度，若显色剂用量在某范围内所测得的吸光度不变，就可在此范围内确定显色剂的加入量。
2.溶液的酸度
溶液的酸度对显色反应的影响很大，它不仅直接影响着金属离子和显色剂的存在形式，而且也影响着有色化合物的组成和稳定性。例如Fe3+与磺基水杨酸的配合反应，当pH=1.8~2.5时，生成1：1的紫红色配合物；pH=4~8时，生成1：2的红色配合物；pH=8~11.5时，则生成1：3的黄色配合物。因此，显色反应通常要求在一定酸度下进行。适宜的酸度可通过实验来确定，方法是：固定溶液中被测组分与显色剂的浓度，改变溶液的pH，分别测出溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，pH为横坐标作图得到的A—pH曲线，曲线上平直部分（吸光度不变）所对应的pH区间，即为最佳的酸度范围。
3．显色时间
有些显色反应速率很快，瞬间即可完成，并且颜色很快达到稳定状态，在较长的时间内保持不变。但大多数显色反应速率较慢，需要一定的时间，溶液才能达到稳定状态。因此，应根据具体情况，掌握适当的显色时间，在颜色稳定的时间范围内进行测定。
4．显色温度
不同显色反应所要求的温度不一样。大多数显色反应可在室温下进行，但有些显色反应需加热至一定温度才能完成。例如，用抗坏血酸作还原剂，以钼蓝法测定磷时，若在室温下显色需要1h，而在沸水浴中显色，10min内就可完成。但应当注意，有些有色化合物在较高温度下容易分解，不利于测定。因此，应根据不同的情况，选择合适的温度进行显色。
5.溶剂
溶剂的性质对显色反应也有影响。有些有色化合物的离解度，在水中比在有机溶剂中大，当溶液中加入可与水混溶的有机溶剂时，可使颜色加深，提高测定的灵敏度；溶剂对有色化合物的稳定性也会发生影响，使颜色改变；某些显色反应的速率也受溶剂的影响。所以，在光度分析中要注意溶剂的选择。
6．共存离子
共存离子在光度分析中的影响是多方面的，主要表现为：共存离子本身有颜色或与显色剂反应生成有色化合物；在显色条件下共存离子水解产生沉淀使溶液混浊；与待测组分或显色剂形成更稳定的配合物，使显色反应不能进行完全等。这些影响可用控制酸度，加入掩蔽剂及分离干扰离子等方法加以消除，也可利用选择适当的波长和合适的参比溶液来避免。
总之，在拟定光度分析方法时，须通过条件实验找出合适的条件后再进行测定。
