一、双指示剂甲醛滴定法
氨基酸含有酸性的COOH基,也含有碱性的一NH2,它们相互作用使氨基酸成为中性的钠盐,不能直接用碱液滴定它的梭基。当加入甲醛时,-NH2与甲醛结合,其碱性消失,使COOH基显示出酸性,可用氢氧化钠标准溶液滴定。
用此法滴定的结果表示a一氨基酸态氮的含量,其精确度仅达氨基酸理论含量的90%。如果样品中只含有某一种已知的氨基酸,从甲醛滴定的结果可算出该氨基酸的含量。如果样品是多种氨基酸的混合物(如蛋白水解液),则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据,但一般常用此法测定蛋白质水解程度,当水解完成后,滴定值不再增加。但应注意,脯氨酸与甲醛作用产生不稳定的化合物,使结果偏低;酪氨酸含有酚羟基,滴定时要消耗一些碱,使结果偏高;溶液中若有铵存在也可与甲醛反应,使结果偏高。
样品中氨基酸含量根据下列公式计算:
X=[(V2一V1)×C×0.014]/V×100
式中:X—氨基酸含量,g/100mL;
V1—中性红作指示剂时消耗氢氧化钠标准液的体积,mL;
V2—百里酚酞作指示剂时消耗氢氧化钠标准液的体积,mL;
C—氢氧化钠标准液的浓度,mol/L;
V—样品液取用量,mL;
0.014—氮的毫摩尔质量,g/mmol。
说明及注意事项如下。
(1)此法适用于测定食品中的游离氨基酸。
(2)固体样品应先进行粉碎,准确称样后用水萃取,然后测定萃取液;液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。萃取可在50℃水浴中进行0.5h即可。
(3)若样品颜色较深,可加适量活性炭脱色后再测定,或用电位滴定法进行测定。
(4)与本法类似的还有单指示剂(百里酚酞)甲醛滴定法,此法用标准碱完全中和COOH基时的pH值为8.5一9.5,但分析结果稍偏低,即双指示剂法的结果更准确。
二、电位滴定法
本法根据酸度计指示pH值控制滴定终点,适合有色样液的检测。
样品中氨基酸含量根据下列公式计算:
X=[(V1一V2)×C×0.014]/(5×V)×100
式中:X—氨基酸含量,g/100mL;
V1—测定用样品加入甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准液,mL;
V2—试剂空白试验加如甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积,mL;
C—氢氧化钠标准液的浓度,moVL;
V—样品稀释液取用量,mL;
0.014—氮的毫摩尔质量,g/mmol。
说明及注意事项如下。
(1)本法准确快速,可用于各类样品游离氨基酸含量测定。
(2)对于混浊和色深样液可不经处理而直接测定。
三、茚三酮比色法
氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用,生成蓝紫色化合物(除脯氨酸外均有此反应),该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比,其最大吸收波波长为570nm,据此可以用吸光光度法测定样品中氨基酸含量。
样品中氨基酸含量根据下列公式计算:
X=c/(m×1000)×100
式中:X—氨基酸含量,μg/l00g;
c—从标准曲线上查得的氨基酸的含量,μg;
m—测定的样品溶液相当于样品的质量,g。
说明及注意事项如下。
茚三酮在放置过程中易被氧化呈淡红色或深红色,使用前须进行纯化。方法为:取10g茚三酮溶于40mL热水中,加入1g活性炭,摇动1min,静置30min,过滤;将滤液放入冰箱中过夜,即出现蓝色结晶,过滤,用2mL冷水洗涤结晶,置干燥器中干燥,装瓶备用。
四、氨基酸自动分析仪法
食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸,经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后,与茚三酮溶液产生颜色反应,再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。可同时测定天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸16种氨基酸,其最低检出限为10pmol。
测定在氨基酸自动分析仪上完成,可控制的操作条件包括缓冲液流量、茚三酮流量、柱温、色谱柱规格。
上机样品液中氨基酸总量根据下列公式计算:
N=(c×A1)/A0
式中:N—上机样品液中氨基酸量,nmol/50μL;
c—上机标准液中氨基酸量,nmol/50μL;
A1—样品峰面积;
A0—氨基酸标准峰面积。
样品中氨基酸含量根据下列公式计算:
X=(N×f×Mr×100)/(m×V×106)
式中:N—上机样品液中氨基酸量,mg/100g;
f—样品的稀释倍数;
Mr—氨基酸的相对分子质量;
m—样品的质量,g;
V—上机时的进样量(此处为50μL)。
说明及注意事项如下。
(1)样品中氨基酸的含量在1.00g/100g以下,保留两位有效数字;含量在1.00g/100g以上,保留三位有效数字。
(2)16种氨基酸相对分子质量;天冬氨酸133.1;苏氨酸119.1;丝氨酸105.1;谷氨酸147.1;脯氨酸115.1;甘氨酸75.1;丙氨酸89.1;纈氨酸117.2;蛋氨酸149.2;异亮氨酸131.2;亮氨酸131.2;酪氨酸181.2;苯丙氨酸165.2;组氨酸155.2;赖氨酸146.2;精氨酸174.2。
(3)标准出峰顺序和保留时间见表,标准图谱如图。
(4)本法为国家标准食物中氨基酸的测定方法,适用于食物中的16种氨基酸的测定,最低检出限为10pmol。但本方法不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食物的测定。