小麦种子过氧化物酶基因wp1的克隆及 在大肠杆菌中的表达
单丽伟,罗海霞,范三红,郭蔼光
( 西北农林科技大学a.理学院,b.生命科学学院,c.陕西省农业分子重点实验室,陕西杨凌712100)
[摘 要] 【目的】克隆小麦种子过氧化物酶基因wp1,并利用原核系统表达纯化。【方法】通过RT-PCR从小 麦未成熟种子中扩增wp1基因cDNA,构建His-tag和MBP融合表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。使用直链淀 粉亲和层析获得MBP-WP1融合蛋白,并以ABTS为底物检测酶活性。【结果】获得的wp1基因cDNA编码一种358 个氨基酸残基的蛋白产物,其序列与大麦BP1相似性高达89%;空间结构预测结果表明,小麦WP1属于第三类过氧 化物酶,具有该家族成员典型的血红素和钙离子结合位点;His-Tag融合的WP1主要以包涵体形式存在,而MBP融 合的WP1主要以可溶形式存在,表达量分别达到总蛋白的18.2%和34.6%;纯化获得的MBP-WP1融合蛋白可检测 到过氧化物酶活性。【结论】使用原核系统可高效表达出可溶性的、具有部分活性的WP1蛋白。
[关键词] 小麦;种子过氧化物酶;高GC含量;基因克隆;基因表达
过氧化物酶广泛存在于植物界,同一个植物中 通常存在多种过氧化物酶同工酶,不同同工酶的表 达模式随组织、发育阶段和环境因素的改变而不同。 植物过氧化物酶(EC 1.11.1.7)参与多种不同的生 理过程,如机体内毒性过氧化物的清除、生长素和细 胞壁的合成、耐受和对抗各种生物胁迫和非生物胁 迫等[1-2]。植物中研究最为透彻的是辣根过氧化物 酶(Horsedimaf peroxidase,HRP),其空间结构已经 解析,催化特点也已阐明[3]。
1991年,Rebmann等[4]首次从小麦叶片中克隆 到病源诱导的过氧化物酶基因。1995年,Baga等[5] 通过PCR从小麦基因组中克隆到3种小麦过氧化 物酶基因(pox1、pox2和pox4)全长序列,以及另外 一种过氧化物酶基因(pox3)部分序列,RNA分析 结果表明,其主要在根组织中表达,其中pox2受白 粉病菌诱导在叶片中高丰度表达[5]。自大规模 EST测序以来,UniGene数据库中已有31种小麦 类过氧化物酶UniGene,其中仅Ta.5385就对应了 278个表达序列。1995年,Converso等[6]从小麦胚 中纯化到3种过氧化物酶组分,并对其催化特征进 行了初步分析;2001年,Caruso等[1]从面粉中纯化 到一种阳离子过氧化物酶(WP1),并证明其具有抗 真菌活性;2002年,Yamashita等[7]从面粉中纯化到 36 ku阳离子过氧化物酶,其N-末端序列分析与大 麦种子过氧化物酶(BP1)高度同源;2007年,本研究 组从面粉中纯化到一种阳离子过氧化物酶,并对其 催化特点、热稳定性等进行了系统分析,质谱分析表 明,该蛋白为小麦种子过氧化物酶WP1[8]。然而, 关于WP1基因的克隆和原核表达研究尚未见报道。 因此,本研究以小麦过氧化物酶表达序列为依据设 计特异引物,通过RT-PCR克隆到小麦wp1,并试 图通过原核表达获得WP1,为进一步阐明WP1在 种子发育中的作用,以及对面粉加工性能的影响奠 定基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 植物材料 从大田采集小麦品种“中国春” 开花后12 d的籽粒,冻存于液氮中待用。 1.1.2 菌株、质粒及主要试剂 RNeasy Plant Mini Kit购自QIAGEN公司; M-MLV Reverse Tran- scriptase、PrimeSTAR(HS DNA Polymerase购自 Takara公司;大肠杆菌菌株T7 Expression和NEB Turbo,限制性内切酶、T4连接酶、amylose resin,DNA Marker和蛋白Marker,均为NEB公司产品;载体 pPCR-Script Amp、pMal-c2x,pET-21a、pET-28a,由陕 西省农业分子重点实验室保存;ABTS(2,2-连氮-双- (3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))购自Sigma公司。 1.1.3 引 物 参考本研究组对纯化到的WP1的 质谱分析结果,以及GenBank中该基因对应的表达 序列标签AL814870和CD915537,设计特异引物:
P1:5′-GAG GAG ATG GCT CGT GCT CCT CTG CTA GCA-3′;
P2:5′-ATG GAA TTC GCG GAG CCT CCG GTG GCG CGC-3′;
P3:5′-ATG AAG CTT CTA GCC AAG CCT TTC TGC AGC-3′。
下划线部分为EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点, 其中P1/P3用于RT-PCR扩增wp1 cDNA(包含完 整CDS),P2/P3用于亚克隆wp1成熟肽编码区。
1.2 RNA的提取及RT-PCR
RNA提取参考RNeasy Plant Mini Kit说明书 进行,提取的总RNA经10 g/L琼脂糖凝胶电泳及 分光光度计法确认RNA的完整性和质量。cDNA 第一链合成参考M-MLV Reverse Transcriptase说 明书进行。PCR扩增体系为20μL,包括ddH2O 5 μL,5×PrimeSTAR Buffer 4. 0μL, 2 mmol/L dNTP 2μL,二甲基亚砜(DMSO)1.6μL,5 mol/L 甜菜碱4μL,PrimeSTAR(HS DNA Polymeras(5 U/μL) 0.5μL,P1、P3 (10μmol/ L)各0.5μL,cD- NA第一链0.5μL。PCR扩增条件为:95℃预变性 5 min;95℃变性60 s,65℃退火30 s,72℃延伸90 s,循环33次;72℃延伸10 min。用10 g/L琼脂糖 凝胶电泳检测扩增结果。
1.3 wp1基因的克隆及序列分析
将1.2中PCR产物直接连接入pPCR-Script Amp载体,转化到NEB Turbo感受态细胞,经蓝白 斑筛选、菌落PCR和酶切鉴定后,送博尚生物技术 公司测序确认。序列相似性分析通过NCBI blast 完成;多序列比对通过DNAstar的Megalign模块 的clustalW算法完成,结果经GeneDOC软件编辑; 三维结构的预测采用Swiss-Model完成(http:// swissmodel.expasy.org),空间结构的可视化使用 Discovery Studio Visualizer2.0软件处理。
1.4 原核融合表达载体的构建及融合蛋白的表达 与纯化
用引物P2/P3从pPCR-WP1载体中扩增获得 WP1成熟肽编码区,扩增体系及PCR反应程序同 1.2。用EcoRⅠ和HindⅢ酶切后连入pET-21a和 pET-28a表达载体,用NdeⅠ和EcoRⅠ从pMal- c2x将MBP(麦芽糖结合蛋白)编码区切出并连入 pET-21a载体,最终获得融合表达载体pET-21a- MBP-WP1和pET-28a-His6-WP1。分别将表达载 体导入大肠杆菌T7 Expression菌株,37℃培养至 对数生长期,加入IPTG(终浓度为0.5 mmol/L)诱 导6 h后收集菌体。用低盐缓冲液(10 mmol/L Tirs-HCl(pH7.6)、50 mmol/L NaCl)重悬菌体,超 声破碎细胞,4℃、12 000 r/min离心。将离心后的 上清液载入Amylose亲和层析柱,依次用5倍柱体 积低盐缓冲液、5倍柱体积高盐缓冲液(10 mmol/L Tirs-HCl(pH7.6)、300 mmol/L NaCl)、5倍柱体积 低盐缓冲液洗柱,最后用洗脱缓冲液(含5 g/L麦芽 糖)洗脱,获得MBP-WP1融合蛋白。使用100~ 200 g/L SDS-PAGE检测总蛋白和纯化后的蛋白, 使用Bio-Rad公司的quantity one软件分析目的蛋 白的表达量。
1.5 过氧化物酶活性的检测
用ABTS法检测融合蛋白的过氧化物酶活 性[9]。取5μL(1 mg/mL)纯化的融合蛋白,加入到 100μL反应缓冲液中,其中含有2. 5 mmol/L ABTS、2 mmol/L H2O2、5 mmol/L CaCl2、50 mmol/L pH4.0的HAc-NaAc。用SpectraMax M5 测定反应产物在405 nm的吸光度值(A405)。
2 结果与分析
2.1 小麦wp1的cDNA克隆
以“中国春”小麦开花后12 d的籽粒为材料,提 取总RNA,从总RNA的电泳结果中可以清晰地分 辨出28,18和5.8 S rRNA对应条带(图1A);以 OligoT18为引物进行反转录,获得cDNA第一链,然 后使用引物P1/P3进行PCR扩增,获得大小为 1 100 bp左右的预期片段(图1B)。测序结果表明, 该片段与最初EST拼接结果一致,包含了小麦wp1 完整的开放阅读框,该阅读框编码358个氨基酸残 基的前体蛋白,推导的蛋白序列与此前本实验室纯 化获得的WP1质谱分析结果一致。
2.2 小麦WP1的序列分析及三维结构预测 使用NCBI的BlastP进行序列相似性搜索,结 果发现,小麦WP1与大麦种子特异表达过氧化物酶 BP1及水稻类过氧化物酶Os01g0963200高度相 似,序列的一致度分别为89%和70%,它们同属植 物过氧化物酶超家族成员。从多序列比对结果(图 2)可以看出,以上3种酶序列在N-末端信号肽区保 守度较低,但在血红素结合位点、钙离子结合位点及 活性中心对应的氨基酸残基高度保守。图3为使用 Swiss-Model预测的小麦WP1和大麦BP1空间结 构(PDB ID:1BGP),从结构图上可以清楚地看到血 红素结合位点和钙离子结合位点,以及WP1和BP1 在空间结构上的高度保守性。
2.3 融合蛋白的诱导表达及纯化
将WP1成熟肽编码区与MBP和His-Tag编 码序列融合,构建了pET-21a-MBP-WP1和pET- 28a-His6-WP1融合表达载体,载体结构如图4A所 示,载体的酶切鉴定结果如图4B所示。将融合表 达载体导入T7 Expression大肠杆菌菌株进行诱导 表达,结果如图5A所示。从图5A可以看出,His- Tag融合的WP1主要以包涵体形式存在,而MBP 融合的WP1主要以可溶形式存在,表达量分别达到 总蛋白的18.2%和34.6%。采用Amylose柱对 MBP融合的WP1进行纯化,获得单点纯化的融合 蛋白MBP-WP1(图5B)。
2.4 融合蛋白MBP-WP1过氧化物酶活性的检测 以ABTS为底物检测MBP-WP1融合蛋白的 过氧化物酶活性,图6反映了不同反应条件下溶液 在405 nm处吸光度的变化。从图6可以看出,加入 Ca2+和不加入Ca2+的对照样品的吸光度值基本一 致,且变化幅度都非常小;加入融合蛋白后吸光度值 有小幅上升,但同时加入Ca2+和融合蛋白WP1后 吸光度值有明显上升。因而MBP融合的WP1有 微弱的过氧化物酶活性,且Ca2+对其有强的激活作 用。
3 讨 论
随着科学技术的进步,基因克隆已变得越来越 容易,但对于某些特定基因,PCR扩增仍然会遇到 不小的难题,比如高GC含量基因和包含重复序列 的区段。本研究初期曾使用过多种DNA聚合酶进 行扩增,但均无结果,甚至从克隆载体中扩增不到条 带;分析小麦wp1的cDNA序列后发现,该基因平 均GC含量为71%,局部区域GC含量在76%以上。 参考文献[10]后,在PCR体系中加入终浓度1 mol/L的甜菜碱和80 g/L的DMSO,结果获得了较 好的扩增效果。DMSO可有效降低模板的解链温 度;甜菜碱有类似功效,且可抑制非特异扩增,增强 长片段扩张,保护聚合酶的催化活性。
利用大肠杆菌表达植物过氧化物酶的报道并不 多见[2,11-12],使用大肠杆菌表达小麦过氧化物酶的 研究未见报道。已有的几篇报道中,目的蛋白主要 以包涵体形式存在,通过变性复性获得部分活性,然 后使用各种方法将活性蛋白和非活性蛋白分开。在 本研究中,关于His-Tag融合的WP1与前人研究结 果类似,表达产物主要以包涵体形式存在;而MBP 融合的WP1主要以可溶蛋白形式存在,降低温度, 延长诱导时间,能提高可溶蛋白所占的比例。MBP 融合的WP1虽然以可溶形式存在,但只能检测到微 弱活性,说明融合蛋白虽然可溶,但绝大部分仍未能 正确折叠,在后续研究中可通过增加分子伴侣、二硫 键异构、在培养基中添加外源血红素等措施,提高酶 蛋白的正确折叠,提高酶的比活力。本研究中,融合 蛋白WP1的活性受钙离子激活,这与Converso 等[13]的研究结果一致。从本研究预测的空间结构 可以看出,小麦WP1具有类似大麦BP1的两个钙 离子结合位点,Ca2+对融合蛋白有激活作用,说明有 少量融合蛋白能正确折叠成活性形式。 小麦种子过氧化物酶WP1在种子发育过程中 表达,在成熟种子中有一定累积。对WP1具体的组 织学定位及在种子发育过程中的具体功能尚不清 楚;在面粉工业中,有研究者通过添加辣根过氧化物 酶、葡萄糖氧化酶、脂过氧化物酶等外源酶改变面粉 加工性能, WP1作为面粉中主要的内源过氧化物 酶,其对面粉的加工性能有何影响,上述问题将是下 一步研究的重点。
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来源：中国化学试剂网
