新型芳基苯并噻唑类发光试剂的合成及光谱性能
胡骥, 李在均, 宋启军
(江南大学化学与材料工程学院,江苏无锡214122)
摘 要:以邻苯二甲酰亚胺为原料,经硝化、还原、巯基化和酰肼化反应合成6-氨基-7-巯基苯二甲 酰肼(AMHP ).AMHP分别与4-甲酰基苯甲醛、4-甲氧基苯甲醛和3, 5-二溴-4-羟基苯甲醛制备 不同的芳基苯并噻唑类发光试剂.对此类发光试剂的光谱行为进行研究,结果表明,芳基苯并噻唑 衍生物是一类优良的发光试剂,在碱性条件下,这些试剂与铁氰化钾反应产生强烈的化学发光现 象.它们中多数试剂的发光强度明显高于传统试剂鲁米诺,尤其以DB-p-H-AMHP发光强度超过鲁 米诺的230倍为最佳,展现出良好的分析应用前景.
关键词:芳基苯并噻唑类试剂;化学发光;合成
化学发光分析不使用光源,可避免光谱法中普 遍存在的杂散光干扰.常用的化学发光体系发光过 程仅在数秒(甚至更短)内完成,加之发光微弱和机 理复杂,客观上要求严格控制操作条件,因此极大 地影响了化学发光法在实际工作中的广泛采用.然 而,随着发光检测技术的改进以及计算机技术的迅 猛发展,化学发光分析法在分析速度、灵敏度和准 确度方面有了显著提高,已在环境、临床、药物、免 疫和生物等相关领域发挥着越来越重要的作 用[1-3].化学发光体系的发光强度即反应灵敏度决定 于跃迁时量子产率的高低,因此,寻找更高效的发光 试剂倍受关注.尽管许多有机化合物(如吖啶酯类、 二氧环乙烷类和洛粉碱类发光试剂)也被合成并应 用于化学发光分析[3],但鲁米诺发光体系因灵敏度 和稳定性均佳仍最为常用.
人们为了进一步改善鲁米诺试剂的发光性能, 相继开发出多种鲁米诺衍生物,大部分新试剂在化学 发光强度方面获得进一步提高[4-7].其中,日本福冈大 学MasatoshiYamaguchi教授合成的含有苯并噻唑 结构的鲁米诺衍生物化学发光强度是鲁米诺的数十 倍(最高达41倍)[7].作者在此基础上,基于取代基对 分析试剂性能影响的规律[8-9],成功设计出3种新型 芳基苯并噻唑类化合物.在碱性条件下,试剂与铁氰 化钾迅速反应产生强烈的化学发光,大多数试剂的发 光强度明显高于传统试剂鲁米诺,尤其以 DB-p-H-AMHP发光强度超过鲁米诺的230倍为最 佳,展现出良好的分析应用前景.
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
1.1.1 试剂 准确称取一定量的芳基苯并噻唑类 试剂配制成1. 0mmol/L的储备液,使用时取出一定 体积储备液稀释成1. 0×10-7mol/L(工作液Ⅰ);准 确称取一定量的铁氰化钾溶于一定浓度的氢氧化 钠溶液,配制成10mmol/L的铁氰化钾溶液(工作液 Ⅱ).所用水均为超纯水(中国华晶公司生产,纯度 为光谱纯).其他试剂均为分析纯,皆由中国医药集 团上海化学试剂有限公司提供.
1.1.2 仪器 78-1型磁力搅拌器,金坛荣华仪器 制造有限公司制造;XM型数显温控仪,上海仪川仪 表厂制造; SHZ3循环水多用真空泵,巩义亚光仪器 厂制造;FTLA2000-104红外光谱仪,加拿大ABB公 司制造;MPI-A毛细管电泳电化学发光监测仪,西安 瑞迈电子科技有限公司制造;RF-5301PC荧光光度 计,日本岛津公司制造.
1.2 3,5-二溴-4-羟基苯甲醛的合成 冰水浴下依次在反应烧杯中加入30 g (0.246 mol)对羟基苯甲醛和100 mL冰醋酸,缓慢滴加30 mL密度为3.12 g/mL的液溴(0.585mol),整个滴加 过程控制温度不超过50℃.加毕,室温放置4 h,再向 烧杯中加入500mL冷水,析出大量白色沉淀.过滤沉 淀,用水洗涤沉淀至流出液为无色,红外灯下干燥得 3,5-二溴-4-羟基苯甲醛65 g,产率为95.1%.
1.3 芳基苯并噻唑类试剂的合成
1.3.1 6-氨基-7-巯基邻苯二甲酰肼 6-氨基-7- 硫基邻苯二甲酰肼(AMHP)的合成反应式为
在装有搅拌子并置于冰水浴的三口烧瓶中加 入350mL质量分数均为98%的浓硫酸和60mL发 烟硝酸,剧烈搅拌下加入50 g邻苯二甲酰亚胺 (0. 340 mol),控制体系温度不高于15℃.反应4 h 后停止搅拌并撤去冰浴,室温下静置过夜.次日,将 反应物缓慢倒入冰水混合物中,析出大量黄色悬浊 物.减压抽滤,并洗涤滤出物4次,用质量分数为 95%的乙醇重结晶,得到淡黄色固体5-硝基邻苯二 甲酰亚胺51 g,产率为78. 1%.
将173 g SnCl2(0. 912 mol)溶于175 mL质量 分数为38%的浓盐酸中,再加66 mL水,恒温控制 在50 ~ 60℃.分批加入30 g 5-硝基邻苯二甲酰亚 胺(0. 156 mol),控温反应2 h,室温下放置过夜.次 日抽滤,以大量去离子水洗涤沉淀,用吡啶重结晶, 烘干得到亮黄色固体5-氨基邻苯二甲酰亚胺15. 5 g,产率为61. 3%.
在置于冰水浴的三口烧瓶中,加入15 g 5-氨基邻 苯二甲酰亚胺(0.092mol)、18.5 gNaSCN(0.226mol) 和300mL甲醇,另将15.5mL密度为3.12 g/mL的液溴 (0.302mol)溶于150mL甲醇并置于滴液漏斗.当烧瓶 中溶液温度到达0℃时,开始逐滴滴加溴的甲醇溶液. 滴加完毕,继续在0℃条件下搅拌2 h,然后室温反应8 h.抽滤得黄色沉淀,真空干燥得产品5-氨基-6-巯基邻 苯二甲酰亚胺12.5 g,产率为53.5%.
将12 g 5-氨基-6-巯基邻苯二甲酰亚胺(0.062 mol)悬浮于200mL的乙醇溶液中,搅拌并恒温至60 ℃.将45mL质量分数为85%的水合肼逐渐向悬浊 液中滴加,滴加2 h,然后回流48 h.反应结束,减压蒸 馏乙醇-水溶剂,无水乙醇重结晶,得鲜红色粉末状 产品6-氨基-7-巯基邻苯二甲酰肼(AMHP) 6 g,产 率为43.3%.产品AMHP的红外光谱与文献报道 一致.
1.3.2 芳基苯并噻唑类试剂 芳基苯并噻唑类试 剂的合成反应为
在装有搅拌子并置于恒温水浴锅的三口烧瓶 中,加入4. 2 gAMHP (0. 020mol)以及相等摩尔数 的4-甲酰基苯甲醛和50 mL N,N-二甲基甲酰胺 (DMF),恒温至52℃,缓慢滴加溶有1. 5 g NaH2PO3浓度为1. 5mol/L的稀硫酸溶液50mL.继 续控温搅拌2 h,然后室温搅拌3 h. 0℃冷却,过滤 沉淀,无水乙醇重结晶产品,得淡黄色固体粉末 p-C-AMHP.其他芳基苯并噻唑类试剂的合成按上 述相似的操作进行,仅采用不同的芳醛替代4-甲酰 基苯甲醛即可.上述各产物的结构采用红外、核磁 (1H-NMR和13C-NMR)和电喷雾质谱进行表征. 芳基苯并噻唑类试剂与合成所用的芳香乙醛 的对应关系见表1.
1.4 化学发光强度的测定 在MPI-A毛细管电泳电化学发光监测仪上,以 工作液Ⅰ为流动相(管内径为1. 0 mm),注射阀注 入50μL工作液Ⅱ,立即发生化学发光反应,记录化 学发光强度.
1.5 化学发光光谱的测定 将荧光光度计与流动注射系统相连接(包括蠕 动泵和流动池),采取两路进样方式操作(管内径均 为1. 0mm).其中一路为1. 0×10-7mol/L的各发光 试剂溶液,另一路为氧化剂溶液,二种溶液在流动 池处混合发生化学反应.在关闭荧光光度计光源下 测定化学发光光谱,开启蠕动泵二路进样开关,在 流动池处发光试剂与氧化剂混合进行化学反应,产 生稳定的化学发光,在300 ~900 nm波长范围内扫 描(扫描速度为1 200 nm/min),记录化学发光光 谱;在打开荧光光度计光源时测定荧光光谱,关闭 氧化剂溶液进样,当流动池内的溶液完全被发光试 剂溶液置换完全后,分别选择不同的激发和发射光 波长,在300 ~ 900 nm波长范围内扫描记录荧光光 谱(扫描速度为1 200 nm/min).
2 结果与讨论
2.1 芳基苯并噻唑类试剂的合成
在芳基苯并噻唑类试剂的合成中,AMHP的制 备最为关键,而其中的巯基化步骤较难控制.由于 NaSCN/Br2巯基化工艺中使用氧化性很强的液溴, 可能会破坏终产物的结构.为此,一方面要严格将 巯基化反应的温度控制在0℃,尽量减少溴对巯基 的氧化;另一方面巯基化粗产品采用无水甲醇反复 洗涤,直至流出液没有颜色,以确保其中残留的溴 完全去除.
2.2 化学发光最佳条件的选择
在化学发光试剂-铁氰化钾体系中,溶液的酸 碱度对发光强度有较大影响.当体系pH为1 ~ 3 时,所有试剂几乎都不发光.随着体系pH的变大, 发光强度缓慢增强.只有采用氢氧化钠溶液控制体 系呈强碱性时,化学发光强度才迅速增加. DB-p-H-AMHP和p-MO-AMHP的发光强度与NaOH 浓度的关系如图1所示.
分别以H2O,CH3OH,CH3CN,DMSO,DMF作 为工作液Ⅰ的溶剂,检测不同溶剂对试剂化学发光 行为的影响(见表2). 可以看出,随着氢氧化钠浓度的增加,发光强 度开始增加,随后增势趋缓,继续增加氢氧化钠浓 度,发光强度将迅速下降.
为保证化学发光体系达到最高的发光强度和稳 定性,采用DMF作为发光试剂的溶剂,且氢氧化钠 溶液浓度为1. 5 mol/L.
2.3 化学发光反应动力学性质
通过对3种新合成的芳基苯并噻唑类化学发光 试剂反应动力学的研究,发现其发光强度随着氧化 剂的注入迅速上升到最大,然后很快下降至基线. 通常,试剂浓度越大发光强度上升或下降所需要的 时间越长,反之就越短(这是因为试剂浓度大化学 反应完成需要更多的时间).当试剂浓度为1×10-7 mol/L时,化学发光反应在1 ~ 3 s内完全进行,发 光强度的衰减迅速,化学发光反应动力学曲线呈现 尖峰状.由于在实际分析应用时,发光试剂的浓度是 非常低的,优异的发光动力学特征不仅可提高化学发 光分析方法的灵敏度,而且还能增加样品分析频次, 这些对生化反应机理探讨和实时分析都是至关 重要的.
2.4 取代基对试剂光谱性能的影响
苯环上引入供电子基团的芳基苯并噻唑类试 剂的化学发光强度明显高于含吸电子基团的试剂, 且含多种供电子基团的试剂好于单一供电子基团 试剂.在它们之中DB-p-H-AMHP发光强度最大,是 鲁米诺发光强度的230倍,当其应用于化学发光分 析可大大降低方法的检出限,展现出良好的应用前 景.为了更好地理解上述规律,作者将3种芳基苯并 噻唑类试剂的荧光和化学发光光谱进行了研究.结 果表明,试剂的荧光光谱最大发射波长随取代基供 电子能力增加而向长波方向移动,这说明供电子基 团的电子效应增加了分子共轭体系中的电荷密度, 使电子易于激发而跃迁.由于溴原子的引入,改变 了苯并噻唑环上的电子云密度,降低了激发态与基 态之间的能级差,提高了分子激发效率和发光效 率,从而增强试剂的荧光和化学发光强度.因此,供 电子基团越多,供电子能力越强,它的荧光光谱最 大发射波长越大,且荧光和化学发光强度也更强.
2.5 化学发光机理
根据试剂分子构型及电荷分布计算结果,推测 该化学发光可能的机理如图2所示.由于在分子中 噻唑环与C—S键中原子上电荷密度大,致使C—S 键易被氧化而断裂,伴随着发生一系列变化,这些 变化过程如图2所示的化学发光反应提供了活化 能,促使它们加快反应速度,从而导致化学发光强 度的增加和动力学特性的改善.
3 结 语
合成了3种新型芳基苯并噻唑类发光试剂,其 中DB-p-H-AMHP的化学发光强度是传统试剂鲁米 诺的230倍,具有很好的分析应用前景.在苯并噻唑 类试剂中同时引入供电子基团或供电子基团组合, 可获得性能更为优异的发光试剂.
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来源：中国化学试剂网
