壳聚糖固定化β-葡萄糖苷酶酶学性质研究
李笑梅,胡 维,高 晗,刘 颖
(哈尔滨商业大学食品工程学院,哈尔滨150076)
摘 要:采用交联吸附法将β-葡萄糖苷酶固定在壳聚糖上,方法简便易行.固定化酶的最适反应温度为50℃,相比于游离酶上升了10℃,且固定化酶提高了游离酶的热稳定性.固定化酶最适pH值为6. 0,与游离酶相比上升了1. 0,更耐碱.固定化酶对化学试剂稳定性增强,贮藏稳定性有显著提高.固定化酶优化了游离酶的部分酶学性质,具有一定应用价值.
关键词:β-葡萄糖苷酶;固定化;酶学性质
中图分类号:O629 文献标识码:A 文章编号: 1672-0946(2010)06-0688-04
β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)是纤维素分解酶系中重要组成成分之一,能催化水解芳香基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖.白藜芦醇具有抗癌和抗心血管疾病等多种生物学功能,是具有广泛应用前景的保健食品功能因子.但白藜芦醇一般以糖苷形式存在,去掉苷能使白藜芦醇表现出更高的活性和保健价值.β-葡萄糖苷酶能够将白藜芦醇糖苷解离成苷元,即白藜芦醇的存在形式从配糖体形式(糖苷形式)向配基体形式(苷元形式)转换,提高白藜芦醇的生物活性.β-葡萄糖苷酶是提高白藜芦醇苷元的关键酶.β-葡萄糖苷酶市场价格昂贵,且使用寿命和贮藏期短,应此工业化受到很多限制,本文以壳聚糖为原料,研究壳聚糖固定β-葡萄糖苷酶的酶学性质及稳定性,旨在提高β-葡萄糖苷酶的可应用性.
1 实验材料与方法
1. 1 实验材料
对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(p-NPG) ,Sigma公司;β-葡萄糖苷酶, Fluka公司;壳聚糖(食品级)和戊二醛等为国产分析纯.
1. 2 实验方法
1. 2. 1 固定化β-葡萄糖苷酶的制备
用质量分数2%乙酸配制1∶20(m /V)的壳聚糖溶液,充分溶解,将壳聚糖溶液逐滴滴入lmol/L氢氧化钠溶液液中,壳聚糖将凝聚成白色颗粒,过滤收集壳聚糖珠,用蒸馏水洗涤至中性,于35℃烘干后,用pH值为5. 0, 50 mmol/L的柠檬酸缓冲溶液浸泡过夜.取预处理的壳聚糖载体1. 0 g,加入pH值为6. 0、质量分数1. 5%的戊二醛1 mL, 30℃下水浴振荡4. 5 h,用上述缓冲液冲洗的交联载体,然后加入5 u酶活的β-葡萄糖苷酶液,水浴2 h,于4℃冰箱中吸附5 h,再用缓冲液冲洗抽滤得固定化酶.
1. 2. 2 β-葡萄糖苷酶活力测定
采用pNPG法测定β-葡萄糖苷酶活力.以每min水解产生0. 01μmol对硝基苯酚的酶量定义为一个酶活力单位(1u).
1. 2. 3 固定化酶酶学性质研究
1. 2. 3. 1 固定化酶最适反应温度
在20~70℃的范围内,每隔5℃测定固定化酶和游离酶酶活,比较不同温度下固定化酶和游离酶的最适反应温度.
1. 2. 3. 2 固定化酶的热稳定性
取游离酶和固定化酶在30~80℃下水浴保持1 h,经流水冷却至室温,测定酶活力.
1. 2. 3. 3 固定化酶最适反应pH值
配制50 mmol/L、pH值为3. 0~6. 0的柠檬酸缓冲溶液, 50 mmol/L、pH值为6. 5~8. 0的Tris-HCl缓冲溶液,测定不同pH值下固定化酶和游离酶的活力,比较不同pH值下固定化酶和游离酶的最佳反应pH值.
1. 2. 3. 4 固定化酶pH值稳定性
取游离酶和固定化酶在上述不同pH值缓冲液中,室温静置3 h后分别测定酶活力.
1. 2. 3. 5 金属离子对游离酶和固定化酶活力的影响
用pH值为5. 0的50mmol/L的柠檬酸缓冲液配制1. 0 mmol/L的MgC12、ZnSO4、EDTA、NaCl、FeCl3、AlCl3、CaC12、CuSO4、KCl、FeS04、MnS04溶液,用这些含金属离子的溶液代替柠檬酸缓冲液,测定固定化酶和游离酶酶活.
1. 2. 3. 6 固定化酶的贮藏稳定性
将制备好的固定化酶及游离酶置于棕色磨口试剂瓶中,室温贮藏,每隔2 d测定1次酶活.
2 实验结果
2. 1 固定化酶的最适反应温度
在不同的温度下,分别测定游离酶与固定酶的酶活力,结果如图1所示.游离酶的最适温度为40℃,固定化β-葡萄糖苷酶的最适温度为50℃,酶的最适反应温度上升了10℃,固定化酶相比于游离酶更耐高温.这可能由于固定化载体改变了酶的构象,从而改变了酶的催化活性.
2. 2 固定化酶的热稳定性
如图2所示,在30~40℃范围内,游离β-葡萄糖苷酶液活力稳定,随着温度升高,β-葡萄糖苷酶液的活力直线下降,60℃时活力损失约88%左右.但固定化酶在30~50℃时活力都稳定,且随温度升高酶活力下降缓慢,在80℃时,活力依然保持21.5%,由此可见酶固定化后,对热的稳定性显著提高.
2. 3 固定化酶的最适pH值
如图3所示,游离酶酶液最适反应pH值为5.0,而固定化酶的最适反应pH值为6. 0,与游离酶相比,经固定化后的酶最适反应pH值会发生变化,这主要是因为固定化导致微环境中微电荷变化.在pH值3. 0~4. 0的范围内游离酶和固定化酶的活力相近,在pH值4. 5~5. 5范围内游离酶酶液活力要高于固定化酶. pH值升高至6. 0以上,固定化酶活力则要显著高于游离酶.固定化酶的耐碱能力增强.
2. 4 固定化酶的pH值稳定性
研究结果显示(见图4),游离酶在pH值5.0左右稳定性最高,而固定化酶在pH值6.0左右稳定性最高,在pH<4.0和pH>5.7时,固定化酶活力大于游离酶活力,由此可看出β-葡萄糖苷酶经固定化后在较低和中性偏高的pH值范围内稳定性提高.
2. 5 金属离子对固定化酶活力的影响试验
考察了几种常见的酶的激活剂和抑制剂对β-葡萄糖苷酶酶液和固定化β-葡萄糖苷酶活力的影响,试验结果显示(图5),Mg2+、Zn2+、ED-TA、Na+、Fe3+、Cu2+、K+、Mn2+对β-葡萄糖苷酶酶液活力有一定的抑制作用,Al3+、Ca2+、Fe2+对β-葡萄糖苷酶酶液活力几乎无影响.β-葡萄糖苷酶固定化后Mg2+、Zn2+、K+抑制作用有所降低,而EDTA和Cu2+、Mn2+对β-葡萄糖苷酶的抑制作用反而加强.
2. 6 固定化酶贮藏稳定性
研究结果显示,固定化β-葡萄糖苷酶活力在贮藏期间缓慢下降, 30 d后残余活力为73. 8%,与贮藏15 d游离酶活力相当.
3 讨 论
β-葡萄糖苷酶在食品行业有广泛应用前景,但酶溶液不能回收,反应时间不能控制,采用壳聚糖固定β-葡萄糖苷酶,以颗粒状反应可回收,可反复利用,且壳聚糖及其分解物无任何毒副作用.壳聚糖固定化β-葡萄糖苷酶制作简单,贮藏性好, 30 d后还保持73. 8%活力.固定化酶最适反应温度和对热的稳定性均有提高.固定化酶最适反应pH值偏中性,更有利于酶促反应的进行.
参考文献:
[1] 李英波,吴国林.β-葡萄糖苷酶及酶固定化研究进展[J].茶叶通报, 2004, 26(1): 21-22.
[2] 邵金辉,韩金祥.β-葡萄糖苷酶在工农医领域的应用[J].生命的化学, 2005, 25(1): 22-23.
[3] FABRIS S, MOMO F, RAVAGNANG,etal. Antioxidantprop-erties of resveratrol and piceid on lipid peroxidation in micellesandmonolamellar liposomes[ J]. Biophysical Chemistry, 2008,135(3): 76-83.
[4] 周 涛,王海洪,魏国乾,等.壳聚糖固定化胰蛋白酶的制备及理化性质研究[J].宁波大学学报, 1999, 12(1): 28-31.
[5] 张正竹,李英波,苏二正,等.β-葡萄糖苷酶的蚕丝素蛋白膜固定化及其性质研究[ J].食品与发酵工业, 2004, 30(6):6-9.
[6] YAN R, LIN L. Purification and characterization of a glucose-tolerantβ-glucosidase from Aspergillus nigerCCRC31494[J].Biosc.i Biotech. Biochem, 1997, 61(6): 965-970.<
来源：中国化学试剂网
