植物淀粉酶活力研究
张 冲
（天津开发区职业技术学院生物技术系，天津 300457）
摘要 从不同萌发时期的小麦中提取淀粉酶，研究在小麦萌发过程中α-淀粉酶和 β-淀粉酶活力的变化，并在测定酶活力的过程中加入不同的化学试剂研究化学环境对2 种淀粉酶活力的影响 。结果表明，不同浓度的硫酸钠 、硫酸铜、氯化钙和氯化铝对 2 种淀粉酶有不同的影响。
关键词 植物；α－淀粉酶；β－淀粉酶；活力；化学环境
中图分类号Q945.34；S512.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2011）09-0013-02
淀粉酶包括几种催化特点不同的成员，其中α-淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等糖类，同时使淀粉浆的黏度下降，因此又称为液化酶；β-淀粉酶每次从淀粉的非还原端切下 1 分子麦芽糖，又被称为糖化酶。几乎所有植物中都存在有淀粉酶，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活力最强。淀粉酶在食品、制酒和制药等工业中有广泛应用[1]。本文通过测定小麦种子不同萌发阶段的淀粉酶活力，寻找 α-淀粉酶和 β-淀粉酶的最适宜提取时期，并进一步研究不同化学环境对 2 种淀粉酶活力的影响，以提高淀粉酶在工业领域的利用效率。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料：小麦种子，品种为河北 9411，由天津玮达生物公司提供。供试仪器为恒温培养箱、721E 型分光光度计、恒温水浴锅、800 型台式低速离心机。试验水为蒸馏水。碘贮存液：于约 400 mL 蒸馏水中溶解 1.7 835 g 碘酸钾、22.5 g碘化钾，缓缓加人 4.5 mL 浓盐酸，边加边搅拌，再用蒸馏水稀释至500 mL，充分混匀，贮棕色瓶于冰箱内保存[2]。碘应用液：贮存液 50 倍稀释，置冰箱内可用 1 个月。1％淀粉：称取10 g 可溶性淀粉 ，加入约 50 mL 蒸馏水使之成糊状后倒入500 mL 沸腾的蒸馏水中，再用蒸馏水洗净小烧杯内淀粉，至少2 次，冷至室温后用蒸馏水稀释至 1 L，于冰箱内保存 。缓冲液：0.1 moL/L pH值为5.6 的柠檬酸缓冲液 （ 每 20 mL 缓冲液中含0.1 moL/L 柠檬酸 5.5 mL 和 0.1 moL/L 柠檬酸钠14.5 mL）。0.1 moL/L H2SO4，硫酸钠 、硫酸铜 、氯化钙 、氯化铝各0.5 moL/L。以上试剂不加说明者，均为分析纯。
1.2 样品制备方法
1.2.1 小麦种子的培养 。供试小麦种子经蒸馏水漂洗浮选后，用 3 倍体积的蒸馏水浸泡，25 ℃恒温培养箱放置 24 h后，转移至铺有纱布的培养皿中，置于 25 ℃恒温培养箱中，每天按时加水。
1.2.2 淀粉酶液的制备。称取 4 g 小麦种子，置于研钵中，加入少量石英砂和10 mL 蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6 mL 蒸馏水分 2 次将残渣洗入离心管 。提取液在室温下放置提取15~20 min，每隔数分钟搅动 1 次 ，使其充分提取。然后在 3 000 r/min 转速下离心 10 min，将上清液倒入100 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度 ，摇匀，即为淀粉酶原液。淀粉酶原液经过 70 ℃水浴 15 min 钝化 β-淀粉酶[3]后，用于 α-淀粉酶活力测定。吸取上述淀粉酶原液 5 mL，放入100 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。
1.3 淀粉酶活力测定方法
在Yoo 改良法[4]基础上略有改动。准确吸取 1 mL 相应酶液（对照管准确吸取 1 mL 蒸馏水），置于比色管中，加入0.1 moL/L pH 值为 5.6 的柠檬酸缓冲液 4 mL 摇匀，于 40 ℃水浴预热5 min，准确加入 1％可溶性淀粉溶液(40 ℃水浴预热)1 mL，立即计时 ，摇匀 ，于 40 ℃水浴准确保温酶解反应5 min 后，加 0.1 moL/L 的 H2SO45mL 终止反应。取 0.5 mL 反应液加入2 mL 碘应用液显色 ，再加入 3.5 mL 蒸馏水摇匀 ，以2 mL 碘应用液加入 4 mL 蒸馏水为空白 ， 在 1 cm 比色皿、620 nm波长下测吸光度。1 个酶活力单位（U）定义为 1 g鲜重种子中的淀粉酶40 ℃ 5 min 内水解 10 mg 淀粉的酶量。淀粉酶活力按以下公式计算[5-6]：
淀粉酶活力=[（AB-AU）/AB]×酶液总体积/4
α-淀粉酶活力=25×（AB-AU）/AB
总淀粉酶活力=500×（AB-AU）/AB
β-淀粉酶活力＝总淀粉酶活力-α-淀粉酶活力
上式中：AB为对照管吸光度，AU为测定管吸光度。
2 结果与分析
2.1 萌发时间对 2 种淀粉酶活力的影响
由表1 可知 ，2 种淀粉酶在萌发过程中活力的变化趋势决定了α-淀粉酶活力占总酶活力的比例在萌发前期迅速升高，在萌发 3 d 达到最高值后缓慢下降，而 β-淀粉酶活力占总酶活力的比例在萌发前期先缓慢下降，在萌发3 d 达到最低值后再缓慢上升。在总淀粉酶活力中 β-淀粉酶活力占据了绝大部分，在萌发过程中 α-淀粉酶活力占总酶活力的比例最高时只有6.17%。为尽可能多的获得 α-淀粉酶，应选择萌发3 d 的小麦种子进行提取 。其变化趋势如图 1 所示。由图1 可知，小麦种子在浸泡之前的休眠状态中 2 种淀粉酶均具有一定的活力，其中α-淀粉酶活力比较微弱，而β-淀粉酶活力较为明显。浸泡 24 h 后，β-淀粉酶活力表现出了明显的下降。从萌发后1 d 开始 2 种淀粉酶活力均稳步增长，其中 α-淀粉酶活力增长迅速，并在萌发的 3 d 活力达到最大，随后α-淀粉酶活力开始缓慢下降。与 α-淀粉酶相比，β-淀粉酶活力增长比较平缓且在测定时间范围内始终保持增长，但从萌发5 d 开始增速放缓。
2.2 化学环境对 2 种淀粉酶活力的影响
取萌发3 d 的小麦种子按 1.2.2 方法制备酶液 。选择硫酸钠、硫酸铜、氯化钙和氯化铝等 4 种常见的盐类，分别配制成0.5 moL/L 溶液。在使用 1.3 方法测定酶活力的过程中，于40 ℃水浴预热前移取不同体积的不同盐类加入到反应体系中摇匀，加盐量如表 2 所示，不足 2 mL 部分用蒸馏水补齐，对照管相应地加入 2 mL 蒸馏水。计算 α-淀粉酶活力和β-淀粉酶活力后，以不加盐时的酶活力为 100%换算成相对酶活力，结果见表 2。
由表2 可知，在测定范围内氯化钙对 β-淀粉酶活力有一定促进作用，加盐量为 0.3 mL 时促进作用最强，酶活力可达无盐时的128.93%，该加盐量下氯化钙对 α-淀粉酶活力也表现为促进，酶活力可达无盐时的 102.90%。但随着加盐量增加，氯化钙对 α-淀粉酶活力表现出缓慢增强的抑制作用。硫酸钠对 2 种淀粉酶活力的影响都不大，在相同加盐量下，α-淀粉酶受到的影响略大于 β-淀粉酶。硫酸铜和氯化
铝对2 种淀粉酶活力都表现出了很强的抑制作用 ，在低加盐量下抑制作用就十分明显，其中加硫酸铜量为 0.3 mL时的β-淀粉酶活力只有无盐时的 67.67%，且随着加盐量提高，抑制作用不断增强。硫酸铜对2 种淀粉酶的抑制作用要强于氯化铝，在一定加盐量范围内β-淀粉酶活力受到硫酸铜和氯化铝的抑制作用要强于α-淀粉酶。
3 结论与讨论
试验结果表明，小麦种子在浸泡之前的休眠状态中2种淀粉酶均具有一定活力，其中α-淀粉酶活力比较微弱而β-淀粉酶活力较为明显。萌发后 2 种淀粉酶活力均稳步增长，α-淀粉酶活力 3 d 达到峰值并开始下降，其占总酶活力的比例也有相同趋势，最高时达6.17％。为尽可能多的获得α-淀粉酶，应选择萌发 3 d 的小麦种子进行提取[6-12]。β-淀粉酶活力始终保持增长。
化学环境变化方面，在测定范围内氯化钙对 β-淀粉酶活力有一定的促进作用；硫酸钠对 2 种淀粉酶活力的影响都不大，在相同加盐量下 α-淀粉酶受到的影响略大于 β-淀粉酶；硫酸铜和氯化铝对 2 种淀粉酶活力都表现出了很强的抑制作用，在低加盐量下抑制作用十分明显 ，在一定加盐量范围内β-淀粉酶活力受到硫酸铜和氯化铝的抑制作用要强于α-淀粉酶[13-14]。
4 参考文献
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来源：中国化学试剂网
