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高效液相色谱法研究香荚兰豆药材指纹图谱

  • 发布日期:2016/10/25 16:07:14 阅读次数:1796
  • 香荚兰豆为兰科香荚兰属植物香荚兰 Vanilla planifoli Andrews 的成熟果实,具有息风止痉、镇静抗惊等功效。 现代研究表明, 其主要化学成分为香兰素,具有镇静和抗惊厥的作用,临床上用于治疗癫痫痛疗效显著。不仅如此,香荚兰豆还是重要的香原料,其独特的香型使其成为食品、饮料、化妆品等产品中的主要配香原料,国内使用的香荚兰豆药材原料主要来源于马达加斯加,但香荚兰豆尚未被中国药典收载,国内外有关文献对香荚兰豆原料质量标准方面的研究报道较少。 本实验采用高效液相色谱法对香荚兰豆指纹图谱进行了研究, 并通过《中药指纹图谱相似度计算软件》计算分析比较,为完善香荚兰豆原料的评价体系和质量标准提供科学依据。

    1 材料

    1.1 仪器 DIONEX-ULTIMATE 3000 高效液相色谱仪, Agilent ZORBAX SB-C18 (250mm×4.6mm,5μ m)色谱柱; UP5200H 超声波清洗器(熊猫集团南京电子计量有限公司); Sartorius CP225D电子分析天平(d=0.01 mg,北京赛多利斯天平有限公司)。

    1.2 试药 香荚兰豆由武汉黄鹤楼香精香料有限公司提供,药材来源于马达加斯加阿诺那香荚兰公司(批号分别为 100101,100302,100403,100604,100705,100906,101107,101208,110109,110310),经湖北中医药大学生药学教研室鉴定为兰科香荚兰属植物香荚兰 Vanilla planifolia Andrews 的成熟果实;香兰素对照品(中国食品药品检定研究院,批号 100491-200901,纯度 99.0%) ;对羟基苯甲酸,香草酸,对羟基苯甲醛对照品(迈舒上海 ELISA 生物技术研究所,批号分别为 583-43-8, 530-57-4, 641-73-7, 纯度分别为 99.0%、98.5%、99.0%) ;甲醇为色谱纯(美国天地公司);其他所用试剂均为分析纯;水为纯化水。

    2 方法与结果

    2.1 色谱条件 色谱柱 Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μ m),以甲醇-水为流动相梯度洗脱;流速为 0.8 ml﹒min-1;柱温为 30 ℃;检测波长为 254 nm;供试品进样量10 μ l;参照物进样量 10 μ l;分析时间:45 min。

    2.2 对照品溶液的制备 分别取香兰素,对羟基苯甲酸,香草酸,对羟基苯甲醛对照品适量,精密称定,加 75%乙醇溶液制成每 1 ml 含 50 μ g 的溶液,即得对照品溶液。

    2.3 供试品溶液的制备 取香荚兰豆原料约 1 g,剪碎,精密称定,精密加入 8 倍量的 75%乙醇溶液,闭塞,称定重量,超声提取,再称定重量,用 75%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液 0.5 ml 至 100 ml 量瓶中,加 75%乙醇定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45μ m)过滤,即得供试品溶液。

    2.4 方法学考察

    2.4.1 精密度试验 精密吸取“2.3”项下供试品溶液 10 μ l,按“2.1”项下的色谱条件连续进样 5 次, 以香兰素峰作为参照峰,计算各峰的相对保留时间及相对峰面积。 结果表明对羟基苯甲酸,香草酸,对羟基苯甲醛各色谱峰的相对保留时间 RSD 分别为 0.14%、0.23%、0.25%,均小于 1%。相对峰面积 RSD 分别为 1.16%、1.03%、1.15%,均小于 1.5%,采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行评价,相似度大于 0.95,结果表明,仪器的精密度良好。

    2.4.2 稳定性试验 取同一香荚兰豆供试品溶液,按 2.1 项下的色谱条件,分别在 0,2,4,8,16,24,36 h 进行检测,以香兰素峰作为参照峰,计算各峰的相对保留时间及相对峰面积。结果表明各色谱峰的相对保留时间 RSD 为 0.37%,0.25%, 0.34%,均小于 1%。 相对峰面积 RSD 为 1.34%, 1.01%,1.15%,均小于 1.5%。 采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行评价,相似度大于 0.95,结果表明,供试品溶液在 36 h 内基本稳定。

    2.4.3 重复性试验 取同一批香荚兰豆原料样品 5 份,每份约 1 g,精密称定,按“2.3”项下方法的方法制备供试品溶液,按“2.1”项下的色谱条件进样分析,结果表明各色谱峰的相对保留时间 RSD 为 0.33%、 0.27%、 0.33%, 均小于 1%。 相对峰面积 RSD 为 0.91%、 0.56%、1.27%, 均小于 1.5%。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行评价,相似度大于 0.93,表明本方法重复性良好。

    3 讨论

    3.1 提取方法的选择 香荚兰豆中的主要特征性成分为香兰素。本试验通过对不同提取溶媒、提取方法进行试验考察,结果表明 75%乙醇提取率最高,超声法比冷浸法的提取方法简便、且提取效率高。按拟定的供试品溶液的制备方法操作,测定的指纹图谱色谱峰分离度大于 1.5。

    3.2 流动相选择 根据参考文献 2 的色谱条件,对样品进行分离,分离效果不佳。在此基础上调整梯度,最终确定了文中所述流动相,可以在保证分离效果的基础上,较大程度缩短分析时间。在此色谱条件下,羟基苯甲酸,香草酸,对羟基苯甲醛、香兰素分离效果良好。
    本文通过 DAD 检测器在 190~400 nm 波长范围内进行光谱扫描,考察所测物质紫外吸收,根据 4 种成分的紫外吸收特性,选取 275 nm 作为检测波长,保证各成分在选定流动相体系中均有较大吸收。

    参考文献:

    [1]江苏省植物研究所.新华本草纲要[M].第 3 册.上海:上海科学技术出版社,1990:613

    [2]左国营,张青,杨翰.国产香荚兰豆有效成分的 HPLC 法测定[J].中国药房,1996,7(6):229-230.

    [3]Keshava C,Keshava N,Ong TM,et a1.Protective effect of vanillin on radiation-induced micronuclei and chromosomal aberrations in V79 cells[J].Mutat Res,1998,397:149-159.

    [4] L.J.Lawler.香荚兰的药疗作用[J].亚热带植物通讯,1991,20(1):64.

    [5]欧阳欢.香草兰产业发展历程和展望[J].农业与技术,2006,26(1):66-68.

    [6]严雨倩,周平坤.香兰素衍生物对细胞增殖和辐射敏感性的影响[J].毒理学杂志,2005,19(3):247.

    [7]陈倩倩,汪黎,尚增甫,等.香兰素衍生物 VND3207 对 α 粒子辐射诱发人成纤维细胞基因组 DNA 损伤的防护研究

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