香荚兰豆为兰科香荚兰属植物香荚兰 Vanilla planifoli Andrews 的成熟果实，具有息风止痉、镇静抗惊等功效。 现代研究表明， 其主要化学成分为香兰素，具有镇静和抗惊厥的作用，临床上用于治疗癫痫痛疗效显著。不仅如此，香荚兰豆还是重要的香原料，其独特的香型使其成为食品、饮料、化妆品等产品中的主要配香原料，国内使用的香荚兰豆药材原料主要来源于马达加斯加，但香荚兰豆尚未被中国药典收载，国内外有关文献对香荚兰豆原料质量标准方面的研究报道较少。 本实验采用高效液相色谱法对香荚兰豆指纹图谱进行了研究， 并通过《中药指纹图谱相似度计算软件》计算分析比较，为完善香荚兰豆原料的评价体系和质量标准提供科学依据。
1 材料
1.1 仪器 DIONEX-ULTIMATE 3000 高效液相色谱仪， Agilent ZORBAX SB-C18 （250mm×4.6mm，5μ m）色谱柱； UP5200H 超声波清洗器（熊猫集团南京电子计量有限公司）； Sartorius CP225D电子分析天平（d=0.01 mg，北京赛多利斯天平有限公司）。
1.2 试药 香荚兰豆由武汉黄鹤楼香精香料有限公司提供，药材来源于马达加斯加阿诺那香荚兰公司（批号分别为 100101，100302，100403，100604，100705，100906，101107，101208，110109，110310），经湖北中医药大学生药学教研室鉴定为兰科香荚兰属植物香荚兰 Vanilla planifolia Andrews 的成熟果实；香兰素对照品（中国食品药品检定研究院，批号 100491-200901，纯度 99.0%） ；对羟基苯甲酸，香草酸，对羟基苯甲醛对照品（迈舒上海 ELISA 生物技术研究所，批号分别为 583-43-8， 530-57-4， 641-73-7， 纯度分别为 99.0%、98.5%、99.0%） ；甲醇为色谱纯（美国天地公司）；其他所用试剂均为分析纯；水为纯化水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱 Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μ m），以甲醇-水为流动相梯度洗脱；流速为 0.8 ml﹒min-1；柱温为 30 ℃；检测波长为 254 nm；供试品进样量10 μ l；参照物进样量 10 μ l；分析时间：45 min。
2.2 对照品溶液的制备 分别取香兰素，对羟基苯甲酸，香草酸，对羟基苯甲醛对照品适量，精密称定，加 75%乙醇溶液制成每 1 ml 含 50 μ g 的溶液，即得对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 取香荚兰豆原料约 1 g，剪碎，精密称定，精密加入 8 倍量的 75%乙醇溶液，闭塞，称定重量，超声提取，再称定重量，用 75%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液 0.5 ml 至 100 ml 量瓶中，加 75%乙醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μ m）过滤，即得供试品溶液。
2.4 方法学考察
2.4.1 精密度试验 精密吸取“2.3”项下供试品溶液 10 μ l，按“2.1”项下的色谱条件连续进样 5 次， 以香兰素峰作为参照峰，计算各峰的相对保留时间及相对峰面积。 结果表明对羟基苯甲酸，香草酸，对羟基苯甲醛各色谱峰的相对保留时间 RSD 分别为 0.14%、0.23%、0.25%，均小于 1%。相对峰面积 RSD 分别为 1.16%、1.03%、1.15%，均小于 1.5%，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行评价，相似度大于 0.95，结果表明，仪器的精密度良好。
2.4.2 稳定性试验 取同一香荚兰豆供试品溶液，按 2.1 项下的色谱条件，分别在 0，2，4，8，16，24，36 h 进行检测，以香兰素峰作为参照峰，计算各峰的相对保留时间及相对峰面积。结果表明各色谱峰的相对保留时间 RSD 为 0.37%，0.25%， 0.34%，均小于 1%。 相对峰面积 RSD 为 1.34%， 1.01%，1.15%，均小于 1.5%。 采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行评价，相似度大于 0.95，结果表明，供试品溶液在 36 h 内基本稳定。
2.4.3 重复性试验 取同一批香荚兰豆原料样品 5 份，每份约 1 g，精密称定，按“2.3”项下方法的方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样分析，结果表明各色谱峰的相对保留时间 RSD 为 0.33%、 0.27%、 0.33%， 均小于 1%。 相对峰面积 RSD 为 0.91%、 0.56%、1.27%， 均小于 1.5%。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行评价，相似度大于 0.93，表明本方法重复性良好。
3 讨论
3.1 提取方法的选择 香荚兰豆中的主要特征性成分为香兰素。本试验通过对不同提取溶媒、提取方法进行试验考察，结果表明 75%乙醇提取率最高，超声法比冷浸法的提取方法简便、且提取效率高。按拟定的供试品溶液的制备方法操作，测定的指纹图谱色谱峰分离度大于 1.5。
3.2 流动相选择 根据参考文献 2 的色谱条件，对样品进行分离，分离效果不佳。在此基础上调整梯度，最终确定了文中所述流动相，可以在保证分离效果的基础上，较大程度缩短分析时间。在此色谱条件下，羟基苯甲酸，香草酸，对羟基苯甲醛、香兰素分离效果良好。
本文通过 DAD 检测器在 190～400 nm 波长范围内进行光谱扫描，考察所测物质紫外吸收，根据 4 种成分的紫外吸收特性，选取 275 nm 作为检测波长，保证各成分在选定流动相体系中均有较大吸收。
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