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草鱼β-肌动蛋白启动子克隆机制

  • 发布日期:2016/10/20 8:48:06 阅读次数:1664
  • 所谓的“全鱼”基因(“all fish”gene)。研究还表明,由鱼的启动子和结构基因组成的“全鱼基因”具有更高表达效率。由于β-肌动蛋白基因(β-actin)启动子为管家型基因的启动子,在许多组织中均有广泛的启动表达功能,因此是转基因鱼研究中使用较多的启动子之一[1,2]。草鱼是我国淡水养殖的主要经济鱼类之一,国内外对草鱼研究报道比较多,但主要集中在人工繁殖、胚胎发育、病害防治等,对其分子生物学上的研究则相对缺乏。由于草鱼亲鱼的个体大、性成熟周期长,给其良种选育带来了困难,目前尚未获得遗传改良的品种或品系。转基因技术是改变动物遗传性状,培育动物新品系的有效途径,且在观赏鱼培育和市场开发上具有较好的实用价值[3]。

    自从第一个单克隆抗体产生以来,单抗已广泛地应用于疾病的诊治上。为了克服传统的鼠源性单抗存在的弊端,随着分子生物学和细胞生物学的快速发展,单克隆抗体的制备技术取得了比较大的进展,包括对鼠源性单抗的改造、人源性单抗的研制及对抗体分子结构和功能的改造,尤其是以噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因/转染色体小鼠技术为代表的人源性单抗制备技术的研制最为瞩目[4]。杂交瘤技术问世并产生出第一个鼠源性单克隆抗体之后,单克隆抗体(简称单抗)已广泛地应用于疾病的诊断与治疗。然而长期以来,临床上使用的单抗多为鼠源性单抗,存在着很大弊端,最突出地表现在其异源性(异质性)所引起的人抗小鼠抗体反应(human anti-mouse antibody response, HAMA)或超敏反应,降低了单抗的效价。

    定量RT-PCR越来越广泛地用于定量基因表达分析。RT-PCR有可能产生错误的结果,因为基因组中可能会产生与一些管家基因常用的转录物相似的假基因,而造成污染DNA的共扩增,它产生与靶基因转录物相似或者大小相同的扩增产物,使mRNA定量表达分析产生错误。人们研究了属于管家基因的肌动蛋白的性质,常常用它的表达来校正定量分析[5]。实验证明,设计准确的β-肌动蛋白的一对特异性引物,能够避免扩增错误,特别适用于小量组织样本的mRNA的定量,如活组织取样分析。例如人弥散性直肠结肠癌细胞中的胸苷酸合酶(TS)mRNA的表达比正常细胞高,该细胞中TS/β-肌动蛋白两种mRNA表达量的比例在0.0003到0.0182(平均0.0035)[6-8]。有人以β-肌动蛋白作为基因表达的参照标准,对正在产蛋、抱窝和用活血肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)免疫的母火鸡的垂体细胞通过狭线印迹(slot blot)杂交分析,结果发现抱窝母鸡的细胞质PRL mRNA转录水平(PLR-肌动蛋白=3.33)高于产蛋火鸡( PLR-肌动蛋白=1.83)。

    在中国水产学中,转基因鱼技术是快速改善水产养殖品种特性的有效途径,而高效启动子区域的分离和鉴定是构建转基因鱼载体的重要环节。目前在转基因鱼中使用的启动子主要有虹鳟(Oncorhyncus mykiss)金属硫蛋白等几种鱼类的β-actin基因启动子,并应用于转基因鱼研究,结果表明β-actin基因启动子能够驱动目标基因的高效表达[9],是构建转基因鱼表达载体最好的启动子之一。为了利用转基因技术培育鲮快速生长新品系,在克隆了鲮生长激素、胰岛素样生长因子和β-actin基因cDNA序列的基础上,采用PCR和一种新的染色体步移法,克隆了鲮β-actin基因启动子,并对其基因组结构和启动子特征进行了分析。该基因的成功克隆为构建转全鱼基因鲮表达载体奠定了基础[10]。

    采用高保真PCR技术从尼罗罗非鱼(Oreochrorrds niloficus)基因组中分离了β-肌动蛋白基因片段序列分析显示该片段包括长为l643 bp/β-actin基因5΄ 端侧翼区的启动调控区和90bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为108bp β-actin基因上游调控序列、β-actin基因不翻译的第1个外显子和第1个内含子。上游调控序列中含有与转录活性密切相关的作用元件:CAAT box,TATA box和CArGbox,分别位于转录起始位点上游的-92、-29和-62处。将尼罗罗非鱼β-actin基因的启动调控区定向克隆到不含启动子的红色荧光表达载体中,构建了重组荧光表达载体。重组载体经EcoR I 线性化后,采用显微注射技术将其注射到唐鱼(Tanichthysalbonubes)的受精卵中,利用荧光显微镜观察外源基因增强型红色荧光蛋白基因(DsRed2)在唐鱼中的表达。结果表明,在荧光显微镜下以及普通解剖镜下均可观察到红色荧光,说明分离到的罗非鱼β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能[11, 12]。

    张殿昌等关于鲮β-肌动蛋白基因和启动子的克隆及序列特征分析中以Actin-FW和Actin-RV为引物,以鲮基因组DNA为模板,经PCR扩增,得到了1条约3.0 kb的条带,经克隆测序证实其为鲮β-actin基因组DNA序列。进而克隆鲮β-actin基因启动子序列,将所克隆的鲮β-actin基因(约3,000 kb)和启动子序列(约1,350 kb)利用DNASTAR软件并借助于手工拼接,共获得4,351 bp的鲮β-actin基因序列,该基因序列在GenBank的登录号为DQ241809。与其他鱼类β-actin基因结构相似,鲮β-actin基因也由6个外显子和5个内含子构成。鲮β-actin蛋白具有两个核输出信号位点(NESl,170~181;NES2,211~222),其为亮氨酸(Leucine)丰富区域,对蛋白质在细胞核和细胞质间的运输起重要作用,说明该研究所克隆的鲮β-actin蛋白为细胞质型β-肌动蛋白。鲮β-actin基因启动子区域具有典型的脊椎动物启动子结构特征,-28~-31为TATA盒,-55~-64为CArG顺势调控元件,-90~-94为CCAAT盒[13]。此外,在启动子的上游区域还有一个CRE结合位点和一个CArG顺式调控元件,并且在内含子1中也含有一个保守的CArG顺势调控元件,对于增强β-actin基因的表达具有重要作用[13]。鲮与其他鱼类β-actin基因启动子区域的序列比对结果表明,已知鱼类的β-actin基因启动子调控元件具有高度的保守性,都具有CCAAT盒、CArG基序和TATA盒3个顺势调控元件,且所处的位置相似[14]。

    胡文革等在准噶尔雅罗鱼β-肌动蛋白基因启动子的克隆及其活性功能初步检测的研究中证实了克隆的准噶尔雅罗鱼β-actin基因启动子SZ21具有启始绿色荧光蛋白基因在真核细胞中转录表达的活性。通过对准噶尔雅罗鱼β-actin基因启动子的克隆、真核表达载体pEGFP-N1-AFPⅢ的构建及鉴定、准噶尔雅罗鱼β-actin基因启动子SZ21在BHK-21细胞中的活性功能鉴定、表达绿色荧光的BHK-21细胞中准噶尔雅罗鱼β-肌动蛋白基因启动子的PCR鉴定[15],胡文革等认为肌动蛋白基因是一个持家基因,在所有的真核生物细胞中高度保真。β-actin启动子包含典型的CAAT框、TATA框及CArT基序,即CC(A/T)6GG序列。但是,β-actin基因可能还有更多的正调控和负调控元件,对于有些特定基因,其转录区内部也存在着转录因子的结合位点,能够对不同的环境条件作出应[15]。

    综上所述,β-actin启动子具有广泛启动表达的功能,具有于SV40早期启动子相当甚至更强的启动转录活性。草鱼β-肌动蛋白启动子克隆及其序列分析对于后续研究启动子的活性及调控功能奠定基础,对构建表达载体进行转基因鱼研究具有重要意义。

    参考文献:

    [1] Du S J, Gong Z, Hew C L . Development of an all-fish gene cassette for gene transfer in aquaculture [J]. 1992(03): 98-112.

    [2]叶星, 刘家照. 麦瑞加拉鲮与鲮的养殖效果及抗寒能力和肌肉营养成分的比较[J]. 中国水产科学, 1999(04): 47-53.

    [3] Parker J D, Rabinovitch P S, Burmer G C. Targeted gene walking polymerase chain reaction [J]. 1991(2): 242-247.

    [4] Higashijim S, Okamoto H, Ueno N . High frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GF P i n whol e muscle s o r th e whol e bod y b y usin g promoter s o f zebrafis h origi n [J]. Mol Cell Biol, 1997(02): 178-223.

    [5] Zhu Z, Xu K, Li G . Biological effects of human growth hormone gene mieroinjected into the fertilized gene of loach Misgurnus anguillicaudatus (Cantor) [J]. 1986(14): 256-261.

    [6] 熊良伟, 王帅兵, 王权. 我国水产生物技术的研究进展[J]. 生物技术通报, 2010(8): 333-345.

    [7] 郁二蒙, 叶星, 王海英, 等. 罗非鱼β-肌动蛋白基因启动子的分离及其启动子活性的初步检测[J]. 农业生物技术学报, 2008, 16(2): 242-247.

    [8] 贺淹才. 肌动蛋白和肌动蛋白基因的研究进展[J]. 生命的化学, 2002(03): 78-86

    [9] Kikuchi K, Muramatsu M, Hirayama Y, et a1. Characterization of the carp myosin heavy chain multigene family [J]. Gene, 1999(02): 189-196.

    [10] 李建林, 俞菊华, 唐永凯. 黄鳝β-肌动蛋白基因的克隆及序列分析[J]. 中国水产科学, 2005(02): 78-96.

    [11] Watabe S. The complete genomic sequence of the carp fast skeletal myosin heavy chain gene[J]. Gene, 2005, 349: 143-151.

    [12] Hwang U W. Cloning and sequences of beta-actin genes from Rhodeus notatus and the silver carp hypophthalmichthys molitrix (Cyprindae)and the phylogeny of cyprinid fishes inferred from beta-acti n gene s [J]. 2002(03): 326-331.

    [13] Hwang G C, Watabe S, Hashimoto K. Changes in carp myosin ATPase induced by temperature acclimation [J]. J Comp Physiol, 1990, B160: 233-239.

    [14] 胡文革, 郝凤霞, 陈创夫, 等. 准噶尔雅罗鱼β-肌动蛋白基因启动子的克隆及其活性功能初步检测[J]. 遗传, 2009(10): 221-231.

    [15] Xia, Lai-Xin, Heng Han-Hu, et al. Characteriation of the β-actin Gene of the Rice Field Eel and It s Phylogen y i n Fis h [J]. ACTA genetica sinica, 2005(07): 97-100.

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