目前，超高效液相色谱法已广泛用于化妆品中孕激素的定量检测，为了使其符合CNAS-CL07:2006《测量不确定度评估和报告通用要求》，且在测量数据的处理、测量结果的表达和测量结果质量评定等方面与国际接轨，笔者根据CNAS-GL06:2006《化学分析中不确定度的评估指南》，对超高效液相色谱法测定化妆品中孕激素(黄体酮)测量结果不确定度进行了测量和评定，为评定测量结果质量提供了科学依据。
一、概述
1.测量方法
《化妆品卫生规范(2007)》规定采用超高效液相色谱法。
2.测量仪器
Waters公司的ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪。
3.环境条件
温度:(20±5)℃；相对湿度:≤75%。
4.测量过程
称取1.00g试样于100mL锥形瓶中，加入饱和氯化钠溶液50mL、硫酸2mL，振荡溶解后转移至100mL分液漏斗。以环己烷30mL分3次萃取，离心分离。合并环己烷并在水浴上馏除。用甲醇溶解残留物，转移到10mL具塞比色管中，用甲醇稀释到刻度。混匀后，经0.45μm滤膜过滤，上机测量，用外标曲线法定量。
二、数学模型
测量结果计算公式:
(1)
式中:X——试样中黄体酮的质量分数，mg/kg；C——由标准曲线得出的试样中黄体酮的质量浓度，mg/L；V——试样定容总体积，mL；M——试样的质量，g。
样品测定结果的不确定度除结果计算公式中的C、V和M因子的影响外，样品的均匀性和处理过程的一致性均会对测定结果产生影响，考虑其影响量，公式中需加入其修正因子fr，式(1)则转化为下列数学模型:
从数学模型中可看出，各影响参数相互独立，且各参数的不确定度直接对被测量X的不确定度产生影响，即灵敏系数等于1，合成标准不确定度可用相对标准不确定度进行合成，根据CNAS-GL06:2006之8.2，合成标准不确定度uc(X)表示为
三、标准不确定度分量的评定
(一)试样处理液中黄体酮含量测定值C的不确定度
1.校准曲线拟合的标准不确定度
校准曲线拟合的标准不确定度是通过对空白和标准系列进行2次重复测定，空白溶液调零，测得其峰面积(y)的，它包含了峰面积重复测量引入的不确定度、仪器数据处理系统引入的不确定度、标准溶液进样量引入的不确定度和曲线拟合相关性引入的不确定度。测定结果如表1所示。
<CTSM>表1校准曲线拟合数据</CTSM>
样品测量的估计值是由实验数据用最小二乘法拟合的直线得到的，其拟合校准曲线参数的标准不确定度可以利用统计程序计算获得。根据测量数据，用线性回归方程y=a+bx求出校准曲线，由最小二乘法分别得到拟合直线的斜率b和截距a:
峰面积测量的标准偏差
应用该曲线进行测量时，对被测样品处理溶液测量8次，即p=8，测得处理液中黄体酮的最佳估计值为8.82mg/L，于是校准曲线拟合的标准不确定度为
相对标准不确定度为
urel(ure)=u(ure)/C=0.082/8.82=0.00929
2.制备标准工作溶液引入的不确定度评定
(1)标准物质引入的不确定度评定
根据标准物质证书提供的信息，黄体酮的不确定度是0.5%。一般认为，标准物质给出的是扩展不确定度，属正态分布，置信概率p=99.7%，包含因子k=3，为B类评定，其相对不确定度为
(2)称量引入的不确定度评定
标准物质的称样量为0.600g，天平检定证书给出的质量允许误差y=±1.0mg，其置信概率p=99.7%，属正态分布，包含因子k=3，则
标准不确定度为
相对标准不确定度为
(3)标准工作液配制过程量器校准引入的不确定度评定
标准工作液制备过程使用了一系列玻璃量具，按照JJG196-2006《常用玻璃量具》检定规程的要求，均有相应的最大允差，按照矩形分布考虑，
，由此估算相对不确定度分量，如表2所示。
<CTSM>表2标准系列配制过程中量具校准引入的不确定度</CTSM>
由表2数据合成的相对标准不确定度:
(4)标准工作液配制过程温度变化引入的不确定度评定
这是由于温度缺乏控制而产生的不确定度。根据制造商提供的信息，该量具已在20℃校准，而实验室的温度在±5℃之间变动，该影响引入的不确定度可通过估算温度范围和体积膨胀系数来计算，液体的体积膨胀明显大于玻璃的体积膨胀，因此，只需考虑前者即可。水的膨胀系数为2.1×10-4℃-1，计算标准不确定度时假设温度变化是矩形分布。
由表3数据合成的相对标准不确定度:
<CTSM>表3温度变化引入的不确定度</CTSM>
(5)制备标准溶液引入的不确定度的合成
由标准物质、称量、量具校准和温度变化引入的标准不确定度分量合成的标准溶液的相对标准不确定度为
3.试样处理液峰面积测量引入的不确定度评定
(1)峰面积重复测量引入的不确定度
通过重复进样进行评定，它包含试样进样量的不确定度，该不确定度属A类评定，由表4数据计算。
<CTSM>表4重复进样测量结果</CTSM>
标准偏差为
标准不确定度为
(2)仪器数据处理系统引入的不确定度
根据仪器说明书和积分仪的一般性能指标分析，目前用于液相色谱仪峰面积积分处理的最大误差为0.2%～1%，取1%，属B类评定，则该峰面积处理引入的相对不确定度为
(3)试样处理液峰面积测量引入的不确定度的合成
由u1rel和u2rel合成的黄体酮试样处理液峰面积测量引入的相对标准不确定度为
由三、(一).1、2和3的不确定度分量合成的样品处理液黄体酮含量测定值C引入的相对标准不确定度为
(二)黄体酮总量的回收率引入的标准不确定度
在样品中加入6mg/L黄体酮标准溶液进行回收率实验，经计算得回收率(n=10)为88.7%，n为得到一个平均值的测量次数。标准偏差为4.3%，相对标准偏差为4.7%。
(三)样品称量m引入的标准不确定度
样品称样量为1.00g，按JJG2053-2006《质量计量器具检定系统》所给出的质量允许差y=±1.0mg，其置信概率p=99.7%，属正态分布，包含因子k=3，则标准不确定度为
相对标准不确定度为
(四)样品处理后的总体积V引入的标准不确定度
1.具塞比色管校准引入的不确定度
样品处理后用10mL的具塞比色管定容，其最大允许误差为±0.1mL，按矩形分布考虑，则标准不确定度为
相对不确定度为
2.温度变化引入的不确定度
在分析测试中测量的温度Tt=22℃，量瓶的校准温度T0=20℃，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，温度变化是矩形分布，则标准不确定度为
相对标准不确定度为
3.样品处理后的总体积V引入的标准不确定度的合成
(五)试样均匀性和处理操作过程(fr)引入的不确定度的评定
检测结果的重现性主要受操作人员样品处理过程的一致性、样品的均匀性和仪器本身的性能因素的影响，该不确定度属A类评定，采用同一样品进行重复实验进行评估。其重复实验结果如表5所示。
<CTSM>表5重复实验结果</CTSM>
单次测量结果的标准偏差:
标准不确定度:
相对标准不确定度为
四、合成标准不确定度评定
由表6中的各相对标准不确定度合成:
<CTSM>表6相对标准不确定度一览表</CTSM>
五、扩展不确定度评定
扩展不确定度可由合成标准不确定度乘以包含因子得到，取置信概率p=95%，则k=2，因此，化妆品中黄体酮含量测定的相对扩展不确定度为
U=urel(X)·k=0.022×2=0.044
由实验数据的平均值计算试样中黄体酮含量的最佳估计值Cx=88.2mg/kg，故其扩展不确定度为
U=88.2mg/kg×0.044=3.89mg/kg
六、测量不确定度报告
化妆品中黄体酮测量结果:
Cx=(88.2±3.9)mg/kg(k=2)
