一、引言
宣威火腿历史悠久，至今已有近300年的历史。2001年，宣威火腿被原国家质量技术监督局正式列为地理标志保护产品，并制定了GB/T18357-2008《地理标志产品 宣威火腿》国家标准。2005年、2006年国家监督抽检中宣威火腿均出现了产品质量问题，这一事件对食品质量安全尤其是防腐作用的监管提出了新的要求。GB/T18357-2008、GB/T5009.29-2003《食品中山梨酸、苯甲酸的测定》、GB/T23495-2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定 高效液相色谱法》、GB/T2730-2005《腌腊肉制品卫生标准》等标准中都未对腌腊肉制品中防腐剂的检测提供相应的分析方法。因此，必须测定宣威火腿中人为添加防腐剂的含量。高效液相色谱法以其操作简单、分析结果准确的特点，成为高盐高脂肪的特殊产品——宣威火腿中防腐剂分析方法的首选。
一、试验部分
1.化学试剂
①试剂:苯甲酸、山梨酸标准物质(来自中国计量科学研究院化学所)；②溶剂:正己烷(分析纯)，甲醇(分析纯、色谱纯)，水(纯水)；③洗液:乙酸铵溶液。
2.玻璃器皿及仪器
锥形瓶，量筒，烧杯，离心管，ENVI-C18SPE柱，样品瓶，0.45μm针头式过滤器，旋转蒸发仪，绞肉机，天平(准确度为0.1g)。
3.仪器工作条件
(1)仪器:DIONEX UltiMate 3000液相色谱仪。色谱条件:洗液，乙酸铵溶液，柱流量为1.000mL/min，自动进样器为WPS3000，进样量为10μL，标温箱为TCC-3000，标温为25℃。检测器:VWD-3400。检测器波长:230nm、254nm。色谱柱:Acclaim120 C18 250×4.6mm。泵:LPG-3400。
(2)流动相:梯度洗脱条件如下:
甲醇(色谱纯)∶乙酸铵溶液(pH=4)=35∶65；检测时间:16min。
4.样品前处理
取5g具有代表性的宣威火腿样品；粉碎后经15mL正己烷，充分振荡去除油脂(3次，每次用超声波清洗器清洗3min)，倒去正己烷；20mL的甲醇(分析纯)溶液，超声清洗15min，滤出清液，再加入5mL的甲醇(分析纯)溶液提取1次，合并洗液；过ENVI-C18SPE柱脱脂脱盐，浓缩后甲醇定容，取上清液过滤等待进样分析。
5.标准溶液配制
(1)标准物质溶液的配制
准确称取(精确到0.1mg)0.1g的苯甲酸、山梨酸标准物质，加甲醇(色谱纯)定容至100mL，制成苯甲酸(浓度为1000mg/kg)、山梨酸(浓度为1000mg/kg)的防腐剂单标标准物质溶液，根据检测器VWD-3000对防腐剂的响应，决定其混合标准物质溶液的浓度:苯甲酸为10mg/kg，山梨酸为10mg/kg。
(2)试样溶液的配制
准确移取50μL苯甲酸、50μL山梨酸的防腐剂单标标准物质溶液于5mL容量瓶中，用甲醇(色谱纯)定容，超声波振荡5min，摇匀，备用。
6.测定
待仪器稳定后，在上述色谱条件下，按照标准物质溶液、试样溶液、试样溶液、标准物质溶液的顺序定性定量分析。
7.定性
将试样溶液中某一色谱峰与混合标准物质溶液中相应的防腐剂成分色谱峰的保留时间进行比较，相对偏差在1%以内，则认为该防腐剂组分确认；相对偏差大于1.0%，则可排除该防腐剂组分的存在，如表1所示。
<CTSM>表1定性工作曲线</CTSM>
表1显示苯甲酸、山梨酸色谱峰与混合标准物质溶液中相应的防腐剂成分色谱峰的保留时间相比较，相对偏差在1%以内。
8.定量
调整试样溶液，进样量形成梯度，作出相应工作曲线，对应的防腐剂组分用外标法定量分析，如表2所示。
<CTSM>表2苯甲酸、山梨酸标准曲线</CTSM>
三、结果及讨论
由于测定的宣威火腿是一类较为特殊的产品，其高盐高脂肪的特性，在现有涉及防腐剂的国家标准、行业标准检测方法中均未涉及。两种常用防腐剂欲达到从宣威火腿中提取，并完全分离有较大的难度。实验中尝试了石油醚、乙醚、正乙烷等多种溶剂对样品进行前处理，甲醇-甲酸、乙醇-氨水-水、氨水-乙酸、甲醇溶液等多种溶液对防腐剂进行提取，结果表明:先用正己烷对样品进行去油脂处理，再用甲醇溶液对防腐剂萃取，效果较好，既可达到完全洗脱高油脂，又可达到高盐的不溶解，避免高盐溶液的通过使得色谱柱中毒，结果表明正己烷和甲醇溶液的配合(利用两种常用的防腐剂)可完全不受高脂高盐的影响从而提取分离。
由于分析对象的特殊性，洗脱液的选择和洗脱梯度配比尤为关键，实验表明甲醇-乙酸胺溶液按35:65配比，检测时间为16min时可以让两种常用防腐剂出峰完毕，且与其他峰完全分离。两种常用防腐剂的标样分离情况如表3所示。
<CTSM>表3标准物质溶液分离结果</CTSM>
色谱峰出峰顺序为苯甲酸、山梨酸。从表3可知，两种常用防腐剂在该条件下16min内可得到良好的分离结果。DOIONEX四元梯度系统流量准确度高，保留时间重复性好，紫外检测器性能稳定，检出限满足国标要求。
1.准确度实验
(1)添加回收率实验
向实际检测的火腿样品中添加2mg/kg、10mg/kg的防腐剂试剂混合标准物质溶液，测定其回收率，如表4所示。
<CTSM>表4添加回收率实验结果</CTSM>
实验表明，宣威火腿样品中人工加入防腐剂能够被提取，2种防腐剂完全分离。添加回收率都在75.0%～110%之间，满足了GB2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》中关于肉及腌腊肉制品中防腐剂不得检出的分析要求。
(2)实际监督抽样的宣威火腿样品分析
实际检测火腿样得出的结果如表5所示。从表5可知，苯甲酸、山梨酸未检出。
<CTSM>表5火腿样实测结果</CTSM>
四、结论与讨论
本方法是针对目前国家标准中尚没有的高盐高脂肪的宣威火腿防腐剂检测提供的完整的实验方法。通过样品前期处理、标样检测、样品加标及计算其回归率可以证明此方法确实可行，用于测定包含上述部分的两种常用防腐剂试样，可一次性完成分析分离、定性、定量，且采用此方法时，宣威火腿中苯甲酸、山梨酸最低检测限分别为0.2mg/kg、0.2mg/kg，满足相应国家标准检测方法中不得检出的标准要求。该方法已用于宣威火腿的监管中，对地方支柱性产业、地理标志性产品——宣威火腿产业的健康发展具有一定的积极作用。
