今天，带你了解色谱法，色谱法是生命科学、材料科学、环境科学等科学领域的重要分析手段，在药物分析中有着极为重要的地位，各国药典都收载了许多药物的色谱分析方法。《中华人民共和国药典》2015年版也不例外：收载了上千个药品用色谱法进行纯度检查、定性鉴别或含量测定。
色谱柱中固定不变的物质是固定相，携带样品向前流动的是流动相，色谱类型较多，从不同角度可以有不同的分类方法：
色谱法分类：
1、按流动相和固定相所处状态分类：
流动相为气体的称为气相色谱，流动相为液体的称为液相色谱。固定相为固体的可分为气固色谱(GSC)或液固色谱（LSC），固定相为液体的有气液色谱（GLC）或液液色谱（LLC）。
2、按固定相的形态分类：可分为柱色谱法、平面色谱法，如，纸色谱法、薄层色谱法等。
3、按分离过程的机制分类：可分为分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法和空间排阻色谱法等类型，后两者只存在于 液相色谱中。
另外，还有其他分离机制的色谱方法，如，毛细管电泳法，根据组分的电泳速度差异而实现分离。
色谱法分类图
色谱流出曲线与有关概念
（一）色谱流出曲线和色谱峰：
1、色谱流出曲线：在色谱分析中,样品流经色谱柱和检测器,所得到的信号-时间曲线,称为色谱流出曲线(elution profile),又称色谱图。
2、基线：在操作条件下，没有组分流出、仅有流动相通过检测器系统时所形成的流出曲线。稳定的基线应是一条平行于横轴的直线，如图所示。基线反映仪器（主要是检测器）的噪声随时间的变化。
3、色谱峰：流出曲线上的突起部分，正常的色谱峰为正态分布曲线，曲线有最高点，以此点的横坐标为中心，曲线对称的向两侧快速、单调下降。
一种组分的色谱峰可用峰高或峰面积（用于定量）、峰位（用保留值表示，用于定性）及峰宽（用于衡量柱效）说明。
色谱流出曲线（色谱图）和区域宽度
（二）保留值：
1、保留时间（retention time）:色谱图横轴上从进样开始到某个组分的色谱峰顶点的时间间隔为该组分的保留时间。
2、死时间：不被固定相保留的组分，从进样到出现峰极大值时的时间间隔。
3、调整保留时间：组分被固定相滞留的时间。
4、保留体积：从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积，单位为mL。
5、死体积：不被固定相保留的组分通过色谱柱所消耗的流动相的体积。
6、调整保留体积：保留体积减去死体积。
7、相对保留值：两组分的调整保留值之比，也是色谱系统的选择性指标。
（三）色谱峰高和峰面积：
1、峰高（peak height, h）：色谱峰顶点至基线的距离。
2、峰面积（peak area, A）：色谱曲线与基线间包围的面积。
（四）色谱峰区域宽度：
1、标准差：正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半。
2、半峰宽：峰高一半处的峰宽。
3、峰宽：通过色谱峰两拐点作切线在基线上所截得的距离。
（五）分离度：又称分辨率或分辨度，它是色谱图中相邻两峰分离程度的量度。
特点：
分离效能高
灵敏度高
样品用量少
分析速度快
应用范围广
固定相：
对固定相要求：
① 在操作温度下应呈液态，且蒸气压要很低，否则易造成固定液流失，使色谱柱寿命下降，检测器本底增高。
② 对各组分应有较高的选择性，即各组分的分配系数有较大的差异，从而获得良好的分离效果。
③ 对分析样品中的各组分有良好的溶解能力。
④ 具有良好的稳定性，即在高温下不分解和不与载体发生化学反应。
⑤ 对载体具有良好的润湿性，能在载体表面形成均匀的薄膜。
固定液的分类：按固定液化学类型分类
烃类、聚硅氧烷类、醇类、酯类
气相色谱仪的维护保养
（1）严格说明书要求，进行规范操作，这是正确使用和科学保养仪器的前提。
（2）仪器应该有良好的接地，使用稳压电源，避免外部电器的干扰。
（3）使用高纯载气，纯净的氢气和压缩空气，尽量不用氧气代替空气。
（4）确保载气、氢气、空气的流量和比例适当、匹配，一般指导流速以次为载气30mL/min，氢气30mL/min，空气300mL/min，针对不同的仪器特点，可在此基础上，上下做适当调整。
（5）经常进行试漏检查（包括进样垫），确保整个流路系统不漏气。
（6）气源压力过低，气体流量不稳，应及时更换新钢瓶，保持气源压力充足、稳定。
（7）新填充的色谱柱不能马上使用还需要进行老化处理，避免固定液流失，产生噪音。
（8）注射器要经常用溶剂（如丙酮）清洗。试验结束后，立即清洗干净，以免被样品中的高沸点物质污染。
（9）要尽量用磨口玻璃瓶作试剂容器。避免使用橡皮塞，因其可能造成样品污染。如果使用橡皮塞，要包一层聚乙烯膜，以保护橡皮塞不被溶剂溶解。
（10）避免超负荷进样（否则会造成多方面的不良后果）。对不经稀释直接进样的液态样品进样体积可先试0.1uL（约100ug），然后再做适当调整。
（11）对于欠稳定的农药、中间体，最好用溶剂稀释后再进行分析，这样可以减少样品的分解。
（12）密封垫分一般密封垫和耐高温密封垫，汽化室温度超过300℃时用耐高温密封垫，耐高温密封垫的一面有一层膜，使用时带膜的面朝下。
（13）保持检测器的清洁、畅通。为此，检测器温度可设得高一些，并用乙醇、丙酮和专用金属丝经常清洗和疏通。
（14）保持气化室的惰性和清洁，防止样品的吸附，分解。每周应检查一次玻璃衬管，如污染，清洗烘干后再使用。
（15）要定期更换空气泵，氢气发生器的硅胶和活性碳。
（16）操作过程中，一定要先通载气再加热，以防损坏检测器。
（17）在使用微量进样器取样时要注意不可将进样器的针芯完全拔出，以防坏进样器。
（18）进样口温度一般应高于柱温30～50度。检测器温度不能低于进样口温度，否则会污染检测器进样口温度应高于柱温的最高值，同时化合物在此温度下不分解
（19）含酸、碱、盐、水、金属离子的化合物不能分析，要经过处理方可进行。
（20）进样器所取样品要避免带有气泡以保证进样重现性。
（21）取样前用溶剂反复洗针，再用要分析的样品至少洗2～5次。
（22）仪器要定期空走程序升温老化柱子，这样会提高柱子的使用寿命和降低仪器污染。
高效液相色谱的那些知识
高效液相色谱法的优缺点
优点：
分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化，应用范围广；
与气相色谱法相比具有的优点：不受试样的挥发性和热稳定性限制，应用范围广；流动相种类多，可通过流动相的优化达到高的分离效率；一般在啊室温下分析即可，不需高柱温。
缺点：
分析成本高，液相色谱仪价格及日常维护费用贵，分析时间一般比气相长。
操作注意事项
1、色谱柱的柱效和保护柱
拿到一根新柱时，一定要先看其使用说明，然后测柱效，定期检测柱效，保留在新色谱柱上得到的色谱图，并记录条件，定期检测仪器的谱带展宽，若应用于在线监测，应对色谱柱提供在线的物理保护和化学保护，例如采取安装在线过滤器，自装填料保护柱和预装保护柱等。在线过滤器的作用是防止颗粒在柱头累计，优点是基本不影响柱效，在需要高柱效的时候常用，常更换的消耗品是滤芯和垫圈。
保护柱的作用是防止柱子被化学污染，缺点是多数保护柱影响色谱柱的柱效，特别是在用微柱时，常用的是普通自装填料的保护柱。最近新出的一些保护柱例如Sentry-guard保护柱,它的特点是高质量、高效填料、增加分析柱效、对脏样品载荷能力大，能延长保护柱的寿命，手可拧紧接头，安装时不需要工具，省时省，可换芯式设计，能采用各种不同的填料，主要适用于非常脏非常复杂的样品本底，例如，生化样品，环境样品和食品等，或者不想做太多的固相萃取，不想降低柱效果等情况。
2、色谱柱的清洗
对所做的样品要有充分的了解，用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗，对于硅胶柱，先用甲醇洗去极性杂质，然后用干燥的二氯甲烷和正庚烷100-200mL 依次活化，对于键和相柱，一般用甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗， 每种色谱柱有特定的清洗方法， 一定要看其使用说明。
3、色谱柱的存放
存放前除去杂质和盐，采用合适的存放溶剂，避免色谱柱床的干枯，避免机械振动，防止细菌生长，注意存放的温度。
色谱柱的常见故障及排除
1、柱压过高
可能是微粒堵塞，柱床膨胀，不可逆吸附，细菌生长等造成的。也有可能是系统反压问题，例如阻尼器堵塞，进样器堵塞，管路或连接口堵塞，在线过滤器不干净，压力传感器不准确等。
2、柱效低
可能是色谱柱被污染、过滤片部分堵塞、色谱柱内的死体积造成，例如，流动相pH值或者组成不合适造成固定相损失，流动相急剧变化造成固定相物理损坏，机械振动造成固定相产生裂缝，柱床收缩或干枯。也有可能是仪器连接的问题，认真检查进样器、检测器、管路、保护柱和在线过滤器等是否连接好，也可能是色谱柱没有平衡好，进样量过大等问题。
3、重复性差、不出峰、回收率低
可能是色谱柱被污染，流动相pH 值或者组成不合适造成固定相损失，样品溶剂不同或样品本身不稳定，固定相极性过强或者流动相极性过弱，或者发生非特异性吸附。也可能梯度实验时平衡时间不足，温度波动，流动相组成改变，样品溶剂不同，样品稳定性不好，方法的开发不好，缓冲液的酸碱度不合适或者缓冲能力不足。
小结
色谱法是先将混合物中各组分分离，而后逐个分析，因此，是分离分析复杂混合物有利手段，具有高灵敏度、高选择性、高效能、速度快、应用范围广等优点。
参考文献:
［1］李发美.医药高效液相色谱技术.人民卫生出版社，2002.
［2］许国旺.现代实用气相色谱分析法.化学工业出版社，2004.6.
［3］武开业.高效液相色谱仪使用及维护保养注意事项.科技信息，2010.
