摘要 建立高效液相色谱同时测定黄酒中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精钠 4 种非法食品添加剂的方法。 黄酒中的待测物质经提取后，采用 C18柱分离，以甲醇 –乙酸铵溶液为流动相进行洗脱，在波长 230 nm处用高效液相色谱 –二极管阵列检测器进行测定。 安赛蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精钠的质量浓度在 0.5～200.0 μg／mL 范围内与其色谱峰面积的线性关系良好 (r ＞ 0.999 7)，检出限为 0.29～0.74 μg／L。 在 0.5，1.0，2.5，5.0，7.5 mg 添加水平时的平均回收率在 95.6%～104.0%范围内，测定结果的相对标准偏差为 0.3%～1.5%(n=6)。该方法操作简便，分离效果好，灵敏度高，结果稳定可靠，适合于黄酒中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精钠的同时测定。
黄酒是一种低酒精度的酿造酒，含有多种氨基酸及微量元素，被誉为 “ 液体蛋糕”［1］。 黄酒以大米、黍米等为主要原料，经加曲、酵母等糖化发酵剂酿制而成［2］。 著名的黄酒有无锡惠泉酒、绍兴加饭酒、丹阳封缸酒、福建龙岩沉缸酒和即墨老酒等［3］。 在黄酒生产过程中生产企业可以根据需要适量添加焦糖色素 ( 通过普通法、氨法或亚硫酸铵法制得 )［4］，但禁止添加安赛蜜 ( 乙酰磺胺酸钾 )、苯甲酸、山梨酸、糖精钠［5］，这 4 种食品添加剂分别有增加甜味及防腐作用。 在江苏省质量技术监督局主导的黄酒产品质量监督抽查中，根据《黄酒产品质量监督抽查实施规范》要求必须检测这 4 个指标［6］。 目前，国内已有分别测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠和安赛蜜的方法［7–10］，但没有出台同时测定这 4 种物质的国家标准。 分开检测费时费力，不但不能提高仪器使用效率，还影响整个监督抽查工作的进度。 笔者研究了同时检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠和安赛蜜的方法，旨在为大批量的黄酒样品的快速、准确检测与便捷数据处理提供参考依据。
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
高效液相色谱仪： 1200LC 型，带 G1315D 型二极管阵列检测器和 LC 3D 系统化学工作站，美国安捷伦科技有限公司；
电子天平： BSA2202S 型，德国赛多利斯科学仪器有限公司；
超声波清洗器： AS20500A 型，天津奥赛恩斯仪器有限公司；
数显恒温水浴锅： HH–6 型，常州国华电器有限公司；
超纯水机： Direct-Q3 型，法国 Millipore 公司；
黄酒样品：生产企业成品库随机抽取；
亚铁氰化钾溶液： 106 g／L ；
乙酸锌溶液： 220 g／L ；
氨水溶液： 0.1% ；
乙酸铵溶液： 0.02 mol／L ；
甲醇：色谱纯，美国 Sigma-Aldrich 公司；
苯 甲 酸 溶 液 [GBW(E)100006]、 山 梨 酸 溶 液[GBW(E)100007]、 糖 精 钠 溶 液 [GBW(E)100008] ：均为 1 mg／m，中国计量科学研究院；
安 赛 蜜 溶 液 （BW3510）： 5，50，100，500，1 000μg／mL，中国计量科学研究院；
标准工作溶液： 量取适量标准溶液，用水稀释配制成所需浓度混合标准溶液，其中苯甲酸、山梨酸、糖精钠为 20，40，100，200 μg／mL，安赛蜜为0.5，10，100，200 μg／mL ；实验所用试剂除注明外均为分析纯；
实验用水：一级水。
1.2 样品处理
称取 5.00 g 试样于 50 mL 比色管中，在水浴锅上去除酒精，用 0.1% 氨水调节 pH 至中性，分别加入 2 mL 亚铁氰化钾溶液和 2 mL 乙酸锌溶液 ( 用于沉淀蛋白质 )，定容至标线，混匀，放置 2 h，取上清液，用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，待上机分析。
1.3 液相色谱条件
色 谱 柱： ZORBAX Eclipse XDB–C18 柱 （250mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司）；
流动相： 甲醇 – 乙酸铵溶液 ( 体积比为 5∶95)，流量为 0.7 mL／min ；柱温： 30℃；检测波长： 230 nm ；
进样体积： 10 μL。
1.4 测定方法
按 1.3 测定标准工作溶液和样液，以待测物色谱峰的峰面积为纵坐标，与其对应的标准工作溶液质量浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线。 同时记录待测物质的光谱图，并与标准品光谱图 ( 见图1～图 4) 对照进行定性分析。
1.5 色谱图
按 1.3 色谱条件进样分析，色谱图见图 5。
2 结果与分析
2.1 色谱条件试验
2.1.1 检测波长
在 214，220，225，230 nm 处 分 别 检 测 混 合 标准溶液，出峰顺序依次为安赛蜜 (6.4 min)、苯甲酸(7.9 min)、山梨酸 (11.0 min) 和糖精钠 (13.2 min)。结果表明，安赛蜜、山梨酸在 214 nm 处峰高最小，在225，230 nm 处峰高较大；苯甲酸峰高变化不大；糖精钠在 230 nm 处峰高最小，在 214 nm 处峰高最大。
综合考虑检测的适用性和灵敏度，实验选择 230 nm为检测波长。
2.1.2 流动相
固定检测波长，分别考察乙酸铵溶液 (0.02mol／L)、甲醇 – 水、乙腈 – 水、甲醇 – 乙酸铵溶液等作为流动相对于待测物色谱峰的影响。
结果表明，采用乙酸铵溶液作为流动相时出峰时间较长； 采用甲醇 – 水溶液、乙腈 – 水作为流动相时几乎不出峰，基线出现漂移； 采用甲醇 –0.02mol／L 乙酸铵溶液 ( 体积比为 5∶95) 作为流动相，能够很好地分离出 4 个峰，15 min 内就可以完成一次检测，为了尽量减少黄酒中夹杂物质 ( 如糖分 )对色谱柱的污染，实验设置检测时间为 25 min，以保证一定的时间冲洗色谱柱。
2.1.3 色谱柱与柱温
实验选用安捷伦公司配备的 ZORBAX EclipseXDB–C18 柱进行检测，待测物质的峰形和保留时间都较好，故没有考虑其它型号的色谱柱。
在检测波长和流动相固定以后，对不同的柱温(25，30，35℃ ) 进行考察。 结果表明，柱温的改变，对待测物质的保留时间和灵敏度影响不大，但随着柱温降低柱压有所下降，实验选择柱温为 30℃，既接近常温，又有较小的柱压，可以得到较为理想的色谱峰形和保留时间。
2.1.4 流速的选择
固定检测波长、流动相、柱温、色谱柱，选择流速为 0.7 mL／min 与 1.0 mL／min 进行比较。结果表明，选用流速为 1.0 mL／min 时，虽然出峰时间缩短，但 4 个峰紧密的排列在一起；选用流速为 0.7mL／min 时峰形分离效果较好，故选择流动相流速为 0.7 mL／min。
2.2 工作曲线及检出限
根据所确定的实验条件，取系列浓度的混合标准溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，其中安赛蜜的浓度为 0.5，10，100，200 μg／mL，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的浓度为 20，40，100，200 μg／mL。 在上述质量浓度范围内，质量浓度 c 与其对应的峰面积 A 呈良好线性关系 (r ＞ 0.999 7)，线性方程与线性相关系数见表 1。
按 3 倍信噪比除以线性方程的斜率计算检出限［11］，本次检测的仪器噪音为 0.008 1，进样量 10μL。 则各待测物质检出限：安赛蜜为 0.57 μg／L ；苯甲酸为 0.53 μg／L ； 山梨酸为 0.29 μg／L ； 糖精钠为 0.74 μg／L。
2.3 精密度试验与加标回收试验
在 1.3 色谱条件下，以未检出本底的某黄酒样品做基质，在 0.5，1.0，2.5，5.0，7.5 mg 添加水平时，每个添加水平重复 6 次测定，计算平均回收率及相对标准偏差 (RSD)，结果见表 2。
结果表明，安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠的加标平均回收率在 95.6%～104.0% 范围内，测定结果的相对标准偏差在 0.3%～1.5% 范围内，回收率和精密度均满足实验要求。
3 结语
建立了用高效液相色谱仪同时检测黄酒中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠的方法。 该方法简便、快速、结果稳定可靠，检出限、回收率和精密度均符合残留分析要求，适用于大批量的黄酒样品的快速准确检测与便捷数据分析。
参考文献
［1］ 傅金泉 . 黄酒生产技术 ［M］. 北京：化学工业出版社，2005: 9–10.
［2］ GB／T 13662–2008 黄酒［S］.
［3］ 黄酒 .360 百科［OL］2704012.html.
［4］ 郝利平 . 食品添加剂［M］. 北京： 中国农业出版社，2004: 112–113.
［5］ GB 2760–2011 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准 ［S］.
［6］ CCGF 103.3–2010 黄酒产品质量监督抽查实施规范［Z］.
［7］ GB／T 5009.28–2003 食品中糖精钠的测定［S］.
［8］ GB／T 5009.29–2003 食品中山梨酸、苯甲酸的测定［S］.
［9］ GB／T 5009.140–2003 饮料中乙酰磺胺酸钾的测定［S］.
［10］ GB／T 23495–2009 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定高效液相色谱法［S］.
［11］ GB／T 5009.1–2003 食品卫生检验方法 理化部分 总则［S］.
