一、保留时间理论
保留时间是样品从进入色谱柱到流出色谱柱所需要的时间,不同的物质在不同的色谱柱上以不同的流动相洗脱会有不同的保留时间,因此保留时间是色谱分析法比较重要的参数之一。
保留时间由物质在色谱中的分配系数决定:
tR=t0(1+KVs/Vm)
式中:tR—某物质的保留时间;
t0—色谱系统的死时间,即流动相进入色谱柱到流出色谱柱的时间,这个时间由色谱柱的孔隙、流动相的流速等因素决定;
K-分配系数;
Vs,Vm—固定相和流动相的体积。
这个公式又叫做色谱过程方程,是色谱学最基本的公式之一。
在薄层色谱中没有样品进入和流出固定相的过程,因此人们用比移值标示物质的色谱行为。比移值是一个与保留时间相对应的概念,它是样品点在色谱过程中移动的距离与流动相前沿移动距离的比值。与保留时间一样,比移值也由物质在色谱中的分配系数决定:
Rf=Vm/(Vm+KVs)
式中:Rf—比移值;
K一色谱分配系数;
Vs,Vm—固定相和流动相的体积。
二、塔板理论
塔板理论是色谱学的基础理论。塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔,待分离组分在分馏塔的塔板间移动,在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡,随着流动相的流动,组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板并不断形成新的平衡。色谱柱的塔板数越多,其分离效果越好。
根据塔板理论,待分离组分流出色谱柱时的浓度随时间呈现二项式分布,当色谱柱的塔板数很高时,二项式分布趋于正态分布。流出曲线上组分浓度与时间的关系可以表示如下:
式中:Ct—t时刻的组分浓度;
C0—组分总浓度,即峰面积;
σ—半峰宽,即正态分布的标准差;
tR—组分的保留时间。
该方程称作流出曲线方程。
根据流出曲线方程,色谱柱的理论塔板高度被定义为单位柱长度的色谱峰方差:
H=σ2/T
理论塔板高度越低,在单位长度色谱柱中的塔板数越多,分离效果越好。决定理论塔板高度的因素有固定相的材质、色谱柱的均匀程度、流动相的理化性质以及流动相的流速等。
塔板理论是基于热力学近似的理论,在真实的色谱柱中并不存在一片片相互隔离的塔板,也不能完全满足塔板理论的前提假设。例如,塔板理论认为物质组分能够迅速在流动相和固定相之间建立平衡,还认为物质组分在沿色谱柱前进时没有径向扩散,这些都不符合色谱柱实际情况,因此塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、峰高,客观地评价色谱柱的效能,却不能很好地解释与动力学过程相关的一些现象,如色谱峰峰型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。
三、范第姆特方程
范第姆特方程(Van Deemter Equation)是对塔板理论的修正,用于解释色谱峰扩张和柱效降低的原因。范第姆特方程将峰形的改变归结为理论塔板高度的变化,理论塔板高度的变化则源于若干原因,包括涡流扩散、纵向扩散和传质阻抗等。
涡流扩散由于色谱柱内固定相填充的不均匀性,同一个组分会沿着不同的路径通过色谱柱,从而造成峰的扩张和柱效的降低。
纵向扩散是由浓度梯度引起的,组分集中在色谱柱的某个区域会在浓度梯度的驱动下沿着径向发生扩散,使得峰形变宽柱效下降。
传质阻抗本质上是由达到分配平衡的速率带来的影响。实际体系中,组分分子在固定相和流动相之间达到平衡需要进行分子的吸附、脱附、溶解、扩散等过程,这种过程称为传质过程,阻碍这种过程的因素叫做传质阻抗。在理想状态中,色谱柱的传质阻抗为零,组分分子流动相和固定相之间会迅速达到平衡。在实际体系中传质阻抗不为零,这导致色谱峰扩散,柱效下降。
在气相色谱中范第姆特方程形式为:H=A+ B/μ +Cμ
式中:H—理论塔板高度;
A—涡流扩散系数;
B—纵向扩散系数;
C—传质阻抗系数;
μ—流动相流速。
在高效液相色谱中,由于流动相赫度远远高于气相色谱,纵向扩散对峰型的影响很小,可以忽略不计,因而范第姆特方程的形式为:
H=A+Cμ