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超氧化物歧化酶研究和应用进展

• 发布日期：2016/12/5 11:08:23 阅读次数：1747
•     超氧化物歧化酶研究和应用进展 
  
      李敬玺1,刘继兰2,王选年1,银　梅1,葛亚明1,唐海蓉1 
  
      (1.河南科技学院,河南新乡453003;2.内黄县畜牧局,河南内黄县456300) 
  
      　摘　要:超氧化物歧化酶是一类广泛存在于动物、植物和微生物多种生物体内的金属酶,与铜(Cu)、锌 (Zn)、铁(Fe)、锰(Mn)等微量元素代谢有密切关系。该酶是生物体内一种重要的氧自由基清除剂,具有重 要的生物学功能,已成为化学、生物学、医学、食品科学和畜牧兽医学等多个学科领域研究的热点。文章从其 来源、种类和分布,结构和理化特性,基因克隆、表达和调控,蛋白的制备,开发应用等方面进行了回顾和综 述,并就存在的问题和前景进行了分析和探讨。 
  
      　关键词:超氧化物歧化酶;蛋白制备;应用 
  
      中图分类号:Q554文献标识码:A文章编号:1007-5038(2007)07-0070-06 
  
      超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD) 是一类广泛存在于生物体内的金属酶,与铜(Cu)、 锌(Zn)、铁(Fe)、锰(Mn)等微量元素(tace ele- ments)代谢有密切关系。该酶由Mann和Keilin于 1938年首次从牛红细胞中分离得到,为一种蓝色含 铜蛋白质(hemocuprein),1969年Mecord和Fri- dovich发现该蛋白具有催化O2发生歧化反应的功 能,故将此酶命名为超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)。
  
      SOD是生物体内一种重要的氧 自由基清除剂,能够平衡机体的氧自由基,从而避免 当机体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良 反应,在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自 身免疫治疗等方面显示出独特的功能,受到国内外 学者和研究者的广泛关注,研究领域已涉及到化学、 生物学、医学、食品科学和畜牧兽医学等多个学科。 因此,深入研究SOD及其与机体内铜、锌、铁、锰等 元素代谢的关系,不仅有着重要的理论意义,而且具 有重要的实用价值。 
  
      1　SOD的来源、种类和分布 
  
      迄今为止的研究表明,SOD广泛存在于多种生 物体内,已从细菌、原生动物、霉菌、植物、昆虫、鸟 类、鱼类和哺乳动物等生物体内分离得到了SOD。 根据其活性中心结合的微量元素离子不同,SOD主 要分为3种类型,即Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe- SOD。Cu/Zn-SOD主要存在于真核细胞的细胞质 中,Mn-SOD主要存在于原核细胞及少数植物细胞, Fe-SOD主要存在于原核细胞和真核细胞的基质 中。3类主要SOD的主要分布如表1所示。 
  
      　除了以上3种SOD外,最近又从链霉菌 Streptomyces spp.和S.coelicotor中即Ni-SOD,另 一种是含铁和锌的酶发现了两种新的SOD,一种是 含镍酶即Fe/ZnSOD,它们均为四聚体,表观分子质 量分别为13 ku和22 ku,它们之间没有免疫交叉反 应[1-3]。 
  
       
  
      2　SOD的结构和理化特性 
  
      2.1　不同SOD的结构 
  
      SOD从结构上可分为2族,Cu/Zn-SOD为第1 族,Mn-SOD和Fe-SOD为第2族。天然存在的 SOD,虽然活性中心离子不同,但催化活性部位却具 有高度的结构同一性和进化的保守性,即活性中心 金属离子都是与3个或4个组氨酸(His)、咪唑基 (Mn-SOD含1个天门冬氨酸羧基配位)和1个H2O 分子呈畸变的四方锥或扭曲的四面体配位。Cu/Zn- SOD作为SOD结构上的第一族,是人们对于SOD 结构研究的突破口,也是人们了解最多的一种 SOD。比较不同来源的Cu/Zn-SOD的氨基酸序列 可以发现,它们的同源性都很高。
  
      如牛红细胞Cu/ Zn-SOD,每个铜原子除分别与4个组氨酸残基 (His44,46,61,118)的咪脞氮配位外,还与一轴向水 分子形成远距离的第5配位,Zn则与3个组氨酸残 基(His6l,69,78)和1个天冬氨酸(D81)配位。Cu、 Zn共同连接组氨酸61组成“咪唑桥”结构。Mn- SOD和Fe-SOD同属于SOD结构上的第2族,Mn- SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体,Mn(Ⅲ) 是处于角双锥配位环境中,其中-轴向配位为水分 子,另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据,另3 个配基His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。 Fe-SOD的活性中心是由3个His,1个Asp和1个 H2O扭曲四面体配位而成。 
  
      2.2　不同SOD的理化特性 
  
      SOD是一种酸性蛋白,在酶分子上共价连接金 属辅基,因此它对热、pH以及某些理化性质表现出 特别的稳定性,其主要理化性质见表2。可以看出, Mn-SOD、Fe-SOD的结构特征是不含半胱氨酸,而 含有较多的色氨酸和酪氨酸,因此紫外吸收光谱类 似一般蛋白质,在280 nm附近有最大吸收峰。Mn- SOD的可见光谱在475 nm处附近有最大吸收,Fe- SOD在350 nm处有最大吸收,这都反映了所含金 属离子的光学性质。 
  
       
  
      3　SOD基因克隆、表达和调控 
  
      不同的物种以不同的形式编码SOD,有多基因 家族也有单拷贝基因。此外,不同细胞定位的SOD 基因结构也存在差别。Fe-SOD和Mn-SOD的基因 来源于共同的祖先基因,具有很高的同源性,氨基酸 序列非常相似,差异仅几个氨基酸。Cu/Zn-SOD的 基因与Fe-SOD和Mn-SOD的基因有不同的祖先基 因,并且在进化上高度保守。SOD基因的突变可导 致一系列异常生命现象的出现,1994年发现SOD 基因的突变可导致家族性的运动神经元萎缩 (FALS)。近年来对SOD家族的深入研究表明[4], 人Mn-SOD是一个由位于6 925位基因编码的抗氧 化酶,由于其紧挨着胶质细胞瘤、淋巴瘤、卵巢癌等 多种肿瘤染色体畸变的频发部位。
  
      有人提出Mn- SOD是潜在的新型肿瘤抑制基因;还有研究表明, Mn-SOD具有抑制肿瘤细胞生长的功能,尤其是对 恶性肿瘤细胞有抑制作用。1993年美国科学家发现 人Cu/Zn-SOD的基因变异是引起家族性肌腱萎缩 性硬化症的一个重要原因。因此,SOD对于遗传疾 患的治疗也有着很大的研究价值和广泛的应用前 景。SOD基因的分子克隆主要采用λ噬菌体载体构 建其cDNA文库,然后用32P的标记的cDNA探针 或抗体探针筛选目的基因的克隆。多种SOD已经 在大肠埃希菌、酵母、病毒、昆虫、哺乳动物等表达, 其中在植物培养细胞中表达最为充分,具有很大的 潜力[5-6]。
  
      Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD 3种酶 都表现出各自特有的调控形式,并且互相影响,在生 命体的抗氧化过程中起着重要的作用。SOD在生命 体中的表达因不同类型而异。Fe-SOD和Cu/Zn- SOD大多数是组成型表达,而Mn-SOD主要是诱导 表达。在生物体中,一种形式SOD的表达受抑制会 导致其他形式SOD表达的增加。相反,外源SOD 基因的过量表达可以降低超氧化物或信号分子的浓 度,从而导致内源SOD基因表达的降低。 
  
      　原核生物SOD基因的表达调控与生长的营养 条件、所处环境有直接的关系,而真核来源的SOD 基因的表达调控则与植物或动物的生长发育阶段、 体内激素有关。但不论是原核生物还是真核生物基 因的表达调控,都是由多个因素共同作用的结 果[7-10]。 
  
      4　SOD研究动态 
  
      4.1　结构性能改造 
  
      SOD半衰期短;分子质量大,不易透过细胞膜; 口服时易受胃蛋白酶分解;体内特异性等结构特点, 限制了其作为药用酶广泛应用于临床。对SOD进 行化学修饰,既能保留天然酶的活性,又能提高其稳 定性。SOD化学修饰的方法主要有3种:①对SOD 的氨基酸残基进行化学修饰,主要是对非活性部位 进行修饰,目的是提高其稳定性,同时保留较高的生 物活性;②用水溶性大分子(如聚乙二醇聚蔗糖、右 旋糖聚烯属烃基氧化物等)对SOD进行共价修饰以 提高酶学特性;③对SOD进行酶切改造,降低相对 分子质量,减小抗原性。研究表明,经过化学修饰后 的SOD基本上保持了天然酶的活性,在耐热、耐酸 碱和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高。 
  
      4.2　SOD模拟研究 
  
      4.2.1　活性中心模拟　由于天然SOD自身存在的 缺点,因此寻找和合成一类既能弥补天然SOD不 足,又具有SOD催化活性的物质(SOD模拟物)的研 究已成为热点。SOD模拟物具有分子质量小、稳定 性高、在体内半衰期长及脂溶性好等优点。人们最 感兴趣的是Cu/Zn-SOD活性中心的模拟研究,可视 为以咪唑桥联的Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)异双核配合物。目 前对Mn-SOD模拟物的研究日益增多,而Fe-SOD 模拟物合成难度较大且活性较低,故其模拟研究较 少。
  
      近年来国内外学者对氨基酸配合物和大环类配 合物进行较为广泛的研究[11-12]。合成了以二肽为配 体的Cu-(Ⅳ-正十二碳酰双甘肽)配合物,这是一个 带功能基的长链Cu (Ⅱ)氨基酸配合物,同时用脉冲 辐解法测定了其SOD活性,较好地模拟了Cu-SOD。 研究了具有Cu/Zn-SOD活性中心类似结构的模型 化合物,深入地探讨了不同的咪唑桥联方式和不同 配位构型对模型化合物催O2-活性的影响。结果表 明,咪唑桥N原子沿四方锥配位底面位置与Cu(Ⅱ) 配位的模拟物活性大大高于沿四方锥轴向与Cu (Ⅱ)配位的模拟物,其活性差异的原因很可能与生 成Cu(Ⅰ)中间体的稳定性有关。
  
      在多核配合物方 面,还根据天然SOD活性部位结构合成了多种含苯 并咪唑的Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、C0(Ⅱ)、Ni (Ⅱ)、Zn(Ⅱ)的配合物,指出配合物活性与其模拟天 然SOD结构微环境程度的大小有关,并将其应用于 植物抗冷胁迫试验。在进行低温胁迫后,经过SOD 模拟物处理对水稻幼苗成活率明显的高于未处理的 幼苗,这些研究成果为研究开发新型农药开辟了新 的途径。人们合成了一系列以水杨醛丙氨酸席夫碱 为配体的Cu(Ⅱ)-Cu(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)-Ni(Ⅱ),Cu(Ⅱ)- Zn(Ⅱ)咪唑桥联的双核配物和相关的单核配合物并 测定其SOD活性。结果表明,双配合比单核配合物 具有更高的SOD活性,这可能与双核配合物的结构 更加类似于天然SOD的活性中心有关。 
  
      4.2.2　胶束模拟　由于SOD在生物体内发挥其效 用时所处的环境大多是非均相的,一些学者采用表 面活性剂在水中形成的胶束体系来模拟上述非均相 反应环境。研究表明,由CTAB(阳离子型表面活性 剂)和SDS(阴离子型表面活性剂)形成的胶束体系 可使多种Cu(Ⅱ)一氨基酸配合物的SOD活性得到 提高,但该体系结构比较复杂,其机理有待进一步探 讨。 
  
      4.2.3　SOD与植物抗逆性　植物在生长发育过程 中可能受到诸如病原菌、水分、大气污染、辐射、温 度、光照、盐碱度和重金属等因素的胁迫。这些胁迫 均能使植物产生过量的活性氧和自由基,引起细胞 结构和功能的破坏。近年来,国内外学者在SOD与 植物抗逆性之间的关系方面开展了大量研究。对干 旱胁迫下内生真菌感染的黑麦草叶中的SOD及其 同工酶的研究表明,随着干旱程度的提高,黑麦草叶 片中SOD及其同土酶活性显著提高,内生真菌的感 染使宿主植物SOD活性对干旱胁迫的反应更为敏 锐。这些研究结果为在沙漠等干旱地区提高植被成 活率提供了理论依据和方法。 
  
      5　SOD蛋白的制备 
  
      自从1973年Weisiger等从鸡肝中首次提取了 两种SOD以来.目前已建立了多种提取纯化SOD 的方法[13-17]。 
  
      5.1　动物源SOD 
  
      动物血来源SOD不仅含量丰富,成本低,且提 取和纯化较方便,作为药用。红细胞膜易破,用常规 分离纯化方法可获得高纯度的SOD。 
  
      5.2　植物源SOD 
  
      植物来源SOD为Cu/Zn-SOD,利于人体吸收。 因此,从植物中提取的SOD安全性很高,避免了可 能发生的交叉感染,且具有明显的社会和经济效益, 市场前景广阔。吉林省昆仑生物科技有限公司长春 市昆仑酶制剂厂2001年研究并开发了玉米提取 SOD的技术。 
  
      5.3　酶法生产SOD 
  
      由于微生物发酵法生产SOD不受季节、气候和 地域的限制,具有生产周期短、产量高、成本低、能大 规模生产等特点,近年来得到了迅速的发展。菌种 是发酵生产酶制剂的重要条件,可考虑筛选或选育 能在极端条件下如嗜热、耐酸、耐碱、抗压等条件生 长的SOD生产菌。必要时还可采取诱导手段,如用 5-溴尿嘧啶诱导酵母SOD表达活性效果明显,可以 在此基础上继续试验,以筛选酵母SOD高产菌株。 目前开发用于SOD发酵生产的菌种有酵母株Y-22, SIPI-215y,ZDF-48;嗜热栖热菌ATCC27634;嗜热 脂肪芽孢杆菌BS21l-15;SOD高产菌株BIT-8701 等;另外,还有大肠埃希菌、乳酸杆菌等。 
  
      5.4　基因重组人源SOD生产方法 
  
      此法提取人SOD基因,经PCR扩增,构建人 SOD的cDNA文库,构建质粒,然后再经质粒转到 受体细胞中,在受体细胞中得以大量表达。基因工 程生产SOD具有以下优点:①生产原料不受限制, 生产工艺稳定;②生产成本低且表达量高;③基因重 组SOD提取的是人SOD基因,不存在非人源物质 应用于人体所存在的免疫排斥;④基因重组SOD不 存在外源性污染问题。 
  
      6　SOD开发应用 
  
      6.1　SOD在食品中的应用 
  
      与其他抗氧化剂一样,SOD可作为罐头食品、果 汁、啤酒等的抗氧化剂,防止过氧化酶引起的食品变 质及腐败现象;还可作为水果、蔬菜等的良好保鲜 剂。由于绝大部分蔬菜、水果都含SOD,其中含量较 高的有刺梨、香蕉、猕猴桃、菠萝、山楂、大蒜等,水果 果皮中SOD活性明显高于果肉。水果中SOD活性 在储藏期间均呈下降趋势。人们利用这些富含SOD 的原料开发了天然保健食品如芦荟汁、大蒜素、刺梨 汁、菠萝汁、麦绿素等。麦绿素是以大麦嫩叶为原料 经浓缩提取的。含SOD的食品还有食用菌、扇贝、 鸡、调味品等。常见食用菌中猴头菇SOD活性较 强,达3 120 U/g湿菌丝。
  
      灵芝菌SOD活性也很 高,已被制成灵芝酒投放市场。常见调味品中,发现 酱油、鱼露、豆腐乳中均含SOD样活性物质,其具体 性质还有待进一步研究。另外,还可将SOD作为营 养强化剂加入食品中制成新的保健食品,如绿茶饮 料有预防龋齿、敏感症、痛风、降压、抑制氧化等作 用;番木瓜SOD酒采用低温生物技术发酵而成,是 一种低度纯天然的绿色健康型果露酒,具有帮助消 化,消除慢性胃炎,舒张血管,降低血压等作用。目 前已开发的还有蛋黄酱、酸牛奶、可溶性咖啡、奶糖 等产品。为扩大SOD在食品中的应用范围,需增强 SOD的稳定性,选择无毒副作用的物质作为修饰剂 进行化学修饰,例如肝素化合物、硫酸软骨素、脂肪 酸等。由玻璃酸、月桂酸修饰的SOD已投入商品化 生产。研究表明,制成SOD脂质体不仅能增强稳定 性,还能促进人体皮肤的吸收。 
  
      6.2　SOD在临床上的应用 
  
      研究表明,SOD具有抗炎、抗病毒、抗辐射、抗衰 老等作用。在病毒性疾病、自身免疫性疾病、心肌缺 血和缺血再灌流综合症、老年性白内障、心血管疾 病、辐射病、癌和癌的放射治疗及人类长寿等领域的 研究己有了突破性进展,也已作为药用酶试用于关 节炎、红斑狼疮等疾病的治疗[18-20]。 
  
      6.3　SOD在其他方面的应用 
  
      SOD既可以作为药用酶,也可作为化妆品的添 加剂,国际生化委员会,美国联邦食品管理局称其为 “抗衰因子”、“美容娇子”,具有抗衰老、防晒、抗炎等 功效。SOD还可以加入到牙膏、漱口水、含片等中, 对预防口腔疾病有一定的疗效。中国农业大学研制 的SOD系列微生物制剂即益微SOD已被推广应 用,与河南省三门峡市科技局联合开发成功的SOD 功能苹果,具有营养、保健、防病等多种作用。 
  
      7　展望 
  
      自1938年首次发现SOD以来,其研究领域不 断扩展,研究内容不断深化。然而,仍有许多问题有 待于进一步研究。理论研究方面,如对SOD进行化 学修饰后,修饰酶的代谢过程及其毒副作用等方面 都需要深入研究;应用研究方面,也有一些问题急待 解决:①临床应用方面需进一步阐明SOD在体内的 抗氧化过程,延长SOD在体内的半衰期,减少其对 机体的毒副作用等;②食品工业方面,要确保口服 SOD有效性,使之不被胃蛋白酶分解等;③化妆品应 用方面,要准确地测定SOD的活性大小,同时要明 确化妆品基质对SOD活性和稳定性的影响等。随 着研究的不断深入,SOD的应用前景将更为广阔。 
  
  

      参考文献:略 

  来源：中国化学试剂网