藻毒素类物质是富营养化水体中最为典型的有毒环境有机污染物之一，尤其随着全球温室效应加剧，有毒蓝藻水华现象频繁发生，造成微囊藻毒素等产毒蓝染加剧。微囊藻水华样品提取物能够诱导人淋巴细胞凋亡，此后又有大量试验证明MCs能够诱导淋巴细胞功能下降。在自然水体中，污染物往往不是单一成分而是多种污染物共存，所以复合污染的毒效应问题成为毒理学关注的热点之一。微囊藻毒素中的MC-LR能够与其它污染物复合作用对水生生物产生影响。MCs 会与消毒副产物CHClBr2 及CHCl2Br 复合诱导鱼淋巴细胞凋亡，而Lindsay等研究发现蓝藻脂多糖)可以降低藻毒素对水蚤(Daphnia spp.)及丰年虫(Artemia salina)的毒性，其LC50分别从2 和1.26 μg•mL-1(单一暴露MC-LR)升至4.9 和4.6μg•mL-1(复合暴露)。
1 材料 供试鲶鱼购自某养殖基地，每尾体长(30±5) cm，体质量(600±10) g，行动活泼、鱼鳍完整舒展，健康。实验室驯养一周后进行试验。
2 供试仪器 Sigma 高速冷冻离心机、细胞培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、恒温水浴箱、Guava easyCyte 8HT 流式细胞仪、环境扫描电镜、凝胶成像系统、酶标仪、分光光度计、荧光定量PCR 仪、超声波细胞破碎仪和Chrom 4TM 检测器。
3 鲶鱼淋巴细胞的分离与培养
在无菌室取出健康鲶鱼头肾，置于预冷的PBS 缓冲液中用眼科剪剪碎，过100 目不锈钢细胞网筛，应用淋巴细胞分离液，5000r·min-1 离心30 min 分离得淋巴细胞，收集的细胞用PBS 洗3 次后置于RPMI1640 培养液(含10%新生小牛血清)中培养，细胞培养箱的温度保持在27 ℃。为排除单核细胞等的干扰，在27 ℃培养2~3 h 后收集上清液，1500 r•min-1 离心10 min，细胞加新鲜培养基(含10%新生小牛血清、100 μg•mL-1 青霉素和100 μg•mL-1 链霉素)重悬，待用。细胞密度控制在1×106 cells•mL-1。
4 细胞周期和凋亡率
将培养2h 的鲶鱼淋巴细胞离心收集(3000 r·min-1，5 min)，然后用4℃预冷PBS 清洗2次，最后在70 %乙醇冰浴过夜。在上机前需在40μm 细胞网筛上过滤，并用100 mg•L-1RNase(Sigma)和50 mg•L-1PI(碘化丙啶，Sigma)缓冲液在室温避光孵育30min，Guava easyCyte 8HT 流式细胞仪(Merck Millipore,Darmstadt, Germany)模块检测细胞凋亡率，分析DNA 含量和细胞周期，得出细胞各周期的百分率。检测激发波长488 nm，发射波长630 nm
5 数据处理
试验数据使用Origin 统计软件(8.0 版)进行处理，采用单侧ANOVA(Student)法进行差异显著性检验(ɑ=0.01)。数据结果以平均数±标准偏差(mean±SD)表示。
6 结果
GST 作为一种细胞质中的超级多功能蛋白，能够降低内源性及外援性化合物毒性。其解毒功能主要是通过催化谷胱甘肽(GSH)的巯基(-SH)结合到疏水化合物上, 使亲脂化合物变成亲水物质, 然后通过胆汁或尿液排泄。同时， MC-LR 能通过与GSH 结合降低毒性(MC-LR: LD50=38 μg•kg-1；MCLR-GSH: LD50=630 μg•kg-1；小型鼠)。
此外，研究证明β-GSTs 中的一种变形酶同样具有结合活性，并且有具有氧化还原活性的二硫键。LPS 与MC-LR 的复合毒性加剧了GST 的减少，导致鱼淋巴细胞内GSH 以及GST 的解毒能力降低，凋亡率增加。GST 除了通过直接结合MC-LR 达到解毒作用外，还可通过减少细胞内氧化自由基数量起到调节氧化应激的作用。
研究表明，LPS 与MC-LR 复合会引起继发性鱼免疫毒性，该结果与Lindsay 等的研究结果相左。主要原因为在于：
1）LPS来源不同。本试验采用的是细菌中的LPS，而Lindsay等所用LPS为蓝藻提取。LPS本身结构繁多，不同结构下其毒性存在较大差异。相较于细菌中LPS，蓝藻中LPS 缺少磷酸根，但具有更多不同种类的不饱和脂肪酸长链以及羟基脂肪酸，此外结构主架中KDO(2-酮基-3-脱氢辛酸)、半乳糖、七碳糖数量也各不相同。
2)试验对象及诱导方式不同。本试验采用鱼淋巴细胞体外诱导方法，而Lindsay 等的试验对象为水蚤(Daphnia spp.)及丰年虫(Artemia salina)，并进行体内诱导。相对体内诱导，体外染毒对象更专一，效果更显著。
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