1材料与方法
(1)菌种
带小棒链霉菌(Streptomycesclavuli-gerus)XC-1-35，系浙江医药股份有限公司新昌制药厂保藏菌株。
(2)培养基及培养条件
斜面及平板培养采用高氏1号培养基，28℃培养8～9d。
种子培养250ml三角瓶装30ml培养基，置旋转式摇床28℃，220r/min振荡培养48h。培养基成分(g/L)：可溶性淀粉15，甘油15，鱼粉20，CaCO33，pH6.5～7.0。
摇瓶发酵250ml三角瓶装30ml培养基，接种量10%，28℃，220r/min振荡培养96h。培养基成分(g/L)：淀粉50，甘油5，黄豆粉30，玉米浆5，CaCl20.1，NaCl0.1，FeSO4·7H2O0.1，MgCl2·6H2O0.1，KH2PO40.8，CaCO33，pH6.5～7.0。
(3)分析方法
克拉维酸含量测定发酵液采用6mol/L盐酸调pH至3.5～4.0，3500r/min离心10min，去除菌丝体和固体残渣，吸取5ml上清液，12000r/min离心10min后，用重蒸水适当稀释，供HPLC检测。色谱条件为：色谱柱C18，ODS(4.6mm×150mm)，柱温25℃。检测器：VWD(SPD-10A)，检测波长220nm，流动相：0.02molKH2PO4∶乙腈(400∶12，体积比)，流速0.7ml/min，进样量10μl。
菌丝浓度测定取10ml发酵液，4000r/min离心15min，测得沉淀物在发酵液中所占的比例即为菌丝浓度。pH测定pH电极测定。
(4)菌种诱变处理
单孢子悬液的制备将冷冻孢子移种子斜面，培养成熟后加入500μg/ml的无菌咖啡因溶液(作助变剂)，刮下孢子并打散，用无菌滤纸过滤即得。
诱变处理吸取5ml单孢子悬液于无菌平板中，置于功率为30W，波长253.7nm的紫外灯直下30cm处开盖振荡照射60s，避光放置过夜，取样经梯度稀释后涂平板，28℃，避光培养9d左右，挑取单菌落转接斜面。
(5)甘油耐受性突变株的筛选
将经紫外线照射的孢子悬液稀释后，分别涂布于含有一定甘油浓度的分离平板上，28℃培养9～12d。
2结果与讨
2.1甘油耐受性突变株的筛选
带小棒链霉菌存在着甘油诱导的甘油转运系统(GTS)，在甘油耐受性高的菌株中GTS活力强，可高效转运甘油合成克拉维酸。为此，试验中采用耐受高浓度甘油的平板筛选UV诱变后的突变株。
(1)菌株XC-1-35对甘油的耐受性考察
分别将未诱变处理和经UV诱变处理后的XC-1-35菌株的单孢子悬液，采用梯度稀释后涂布于含不同浓度甘油的分离平板上，结果如研究发现，未经处理的对照组在含12%以上甘油浓度的平板上无菌落生长，其甘油耐受浓度为10%；经UV诱变处理的诱变组在含14%甘油浓度的平板上还可生长出少量呈光秃型的小菌落，并且随着平板中甘油浓度的增加，菌落的生长速度也随之减慢，其培养时间由对照的9d延长到13d。
(2)甘油耐受性突变株的选育
将经UV诱变处理60s后的XC-1-35单孢子悬液适当稀释后涂布在含14%甘油浓度的分离平板上进行培养，筛选耐高甘油浓度突变株，共挑取了93支耐受菌株转接斜面。摇瓶发酵初筛及复筛结果表明，采用筛选甘油耐受性突变株的选育效果比较理想，正变率达到63.3%，负变率仅为3.3%。利用该抗性突变株筛选方法，试验中共进行了5轮的菌种选育，得到高产菌株XC-5-48的效价达1970μg/ml，为出发菌株(318μg/ml)的6.2倍。该诱变株经斜面连续传代4次，发酵效价稳定在1800μg/ml以上，表明其高产性能稳定，可用于进一步的对照组和诱变组的甘油耐受浓度比较验。
2.2突变株XC-5-48与出发菌株XC-1-35的生理特性研究
Miuambres等认为克拉维酸产生菌中具有两种不同的转运甘油分子系统。其中透过细胞90%以上的甘油是由甘油转运系统(GTS)转运的。GTS是一种分布于细胞膜上的透性酶(转运酶系)，酶活性的最适pH为7.0，最适温度为23～35℃，Km为14μmol/L，半衰期为8h左右。该透性酶的活性中心含有-SH基团，其转运能力与细胞膜结构的完整程度相关，并受到L-丝氨酸等某些物质的抑制。为此，试验中通过向发酵培养基中添加不同浓度的影响GTS系统活性的因素，如丝氨酸、碘乙酸、脂肪酸，分别观察其对突变株XC-5-48与出发菌株XC-1-35的生长代谢及产物合成的影响，以了解突变株的生理特性。
